西藏那曲市1株牦牛源產氣莢膜梭菌的分離鑒定

羅潤波,高家登,錢雯嫻,周賽賽,索朗斯珠*

（1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏那曲市畜牧獸醫技術推廣站，西藏 那曲 852000）

產氣莢膜梭菌，舊稱魏氏梭菌、產氣莢膜桿菌，是一種臨床條件致病菌，廣泛分布于人、環境和牲畜的胃腸道[1-4]，是造成動物壞死性腸炎、腸毒血癥、氣性壞疽的主要病原菌之一。產氣莢膜梭菌所產生的毒素種類較多，目前已發現的毒素至少20種[5]，且均為蛋白質。根據該菌產生四種主要致死性毒素（α、β、ε和ι）的種類不同而被分為A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι） 五 種毒素類型[6]。

產氣莢膜梭菌引起的牦牛疾病時有報道[7-9]。西藏地區也有發生不明原因的牦牛死亡，死亡?？梢娝闹昂笊熘薄⒖谇涣饕后w、肛門外翻且充血、腹瀉等癥狀，部分牦牛病程3～5 d、有的1 d死亡。剖檢可見實質器官的廣泛性出血。小腸針尖樣出血，也可見“血腸樣”，大腸充氣、黏膜出血，膽囊高度腫脹，膀胱積尿，皺胃黏膜充血，瘤胃可見血塊。

為確診該病病原，本試驗采集病死牦牛的肝臟、腎臟、心臟、脾臟、小腸內容物等病料，實驗室進行細菌分離，通過分離鑒定，以確定引起該牦牛死亡的主要病原菌。

1 主要材料

1.1 病料

采集一頭疑似產氣莢膜梭菌感染引起死亡的牦牛的肝臟、腎臟、心臟、脾臟以及小腸內容物。

1.2 主要試劑及儀器

哥倫比亞血瓊脂平板（江門市凱林貿易有限公司），厭氧罐、厭氧產氣袋（日本三菱化學公司），厭氧肉肝湯培養基、卵黃瓊脂培養基、石蕊牛奶培養基、梭菌增菌培養基（青島海博生物技術有限公司），生化鑒定管（青島海博生物技術有限公司），引物合成（生工生物工程上海股份有限公司），PCR相關試劑（北京全式金生物技術有限公司），恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad生產）。

2 細菌的分離鑒定

2.1 病料接種

將病料接種在厭氧肉肝湯中，37℃厭氧培養18～24 h，培養過程中觀察細菌是否生長和產氣。同時將病料進行觸片，革蘭氏染色鏡檢，觀察病料中細菌的形態特征。

2.2 分離培養

將厭氧肉肝湯中明顯渾濁并有氣體產生的菌液，在哥倫比亞血平皿上劃線，血平皿放入厭氧罐37℃培養18～24 h。

挑取哥倫比亞血平皿上有細菌生長、并形成溶血環的單菌落，進行細菌涂片，革蘭氏染色后鏡檢，觀察細菌是否與病料觸片染色鏡檢結果相同。鏡檢結果一致的菌落接種在梭菌增菌培養基中，37℃厭氧培養18～24 h，用作后續實驗。

2.3 生化試驗

生化鑒定參照伯杰細菌鑒定手冊[10]，將上述菌液分別接種于新鮮制備的石蕊牛奶培養基、酪蛋白瓊脂培養基、卵黃瓊脂培養基中，并分別接種到吲哚、酯酶、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、水楊苷等生化鑒定管中，37℃培養，24 h，觀察并記錄實驗結果。

2.4 16S rRNA的分子生物學鑒定

取梭菌增菌培養基中的分離菌純培養物，進行集菌，并采用煮沸法獲得總DNA。采用細菌16S rRNA的通用引物進行擴增[11]，引物信息見表1。PCR反應體系，50 μl：DNA模板2 μl，2× Mix 25 μl，上、下有引物各1 μl ，ddH2O 21 μl。PCR反應體系94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環，72℃延伸10 min。PCR產物采用1%凝膠電泳檢測，目的條帶切膠回收，然后連接T載，連接后轉化到Trans5α，挑選陽性菌送“生工生物工程（上海）股份有限公司”測序。并在GenBank中進行比對。

3 結果

3.1 分離菌菌落形態及培養特性

細菌在哥倫比亞血平皿上可見菌落凸起，呈圓形，邊緣整齊，表面光滑，菌落周圍有明顯的溶血環。細菌厭氧生長，在厭氧肉肝湯中生長迅速，產生大量氣體，培養基混濁。

3.2 分離菌菌體形態

挑取哥倫比亞血平皿上形成溶血環的單菌落進行涂片，用革蘭氏染色，鏡下見革蘭氏陽性細菌，單個或成雙存在，兩端鈍圓，形態粗短，無鞭毛。病料觸片染色結果與哥倫比亞血液瓊脂平板上有溶血環的菌落的菌體形態一致。

3.3 分離菌的生化試驗

該分離菌接種到石蕊牛奶培養基中，表現為明顯的“洶涌發酵”。其余生化試驗結果見表2。

3.4 16S rRNA 分子生物學鑒定結果

以分離菌總DNA為模板擴增得到的PCR產物進行1%凝膠電泳，結果顯示與預期大小1300 bp一致，見圖1。將PCR產物回收連接T載體后轉化到Trans5α進行測序，結果表明該分離菌的16S rRNA序列得到了有效擴增，序列比對結果顯示分離株與產氣莢膜梭菌XJWB01（GenBank登 錄 號：KX094441.1） 和KSJ-23（GenBank登錄號： MG462900.1），同源性均為99.47%。表明分離菌為產氣莢膜梭菌。

4 小結及討論

本研究通過臨床癥狀的初步判定并進行病原菌的分離培養、生化試驗、分子生物學試驗，成功分離得到西藏那曲市牦牛源產氣莢膜梭菌1株。

表1 16S rRNA生物學鑒定引物

表2 分離菌生化實驗結果

圖1 16S rRNA特異性鑒定

產氣莢膜梭菌是一種梭狀芽孢桿菌屬的條件性致病菌，同時也是動物腸道中的正常菌群之一[1-3]，動物機體的抵抗力一旦下降，可致使腸道內的產氣莢膜梭菌大量增殖產生外毒素，外毒素能使腸壁通透性增加，而后細菌和毒素就會透過腸壁，進入血液，從而引起毒血癥或者敗血癥，實質性器官則受損嚴重［12］。本研究從采集的實質性器官和小腸中均分離到了產氣莢膜梭菌，基本可以確診牦牛的死亡由該病原菌引起。

該菌是人獸共患傳染病原，能引起人類食物中毒和創傷性氣性壞疽。人類、畜禽以及土壤、污水中最常見的產氣莢膜梭菌是A型產氣莢膜梭菌[13]，也有研究發現，A型產氣莢膜梭菌是牛的“猝死癥”的主要病原之一[14]。同時A型和B型產氣莢膜梭菌能引起牛的腸毒血癥病。但近幾年，D型梭菌導致的牛腸毒血癥呈上升趨勢[15]，國外則多見C型和D型產氣莢膜梭菌[16]。國內也有學者報道E型產氣莢膜梭菌能感染牦牛，引起一系列疾病[17]。本次分離得到的1株牦牛源產氣莢膜梭菌具體是何種毒素型，有待進一步研究。

臨床上，應提高對該病的重視，有條件的可以進行相應的疫苗預防。對于患病牦牛，應及時進行隔離治療，主要是鎮靜、消炎和強心。對于死亡牦牛要嚴格進行無害化處理，同時要注意場地的消毒。