一株西藏牦牛源腸球菌的分離鑒定

孔新平，周 磊，王漢鼎，吳慶俠，董海龍

（西藏農牧學院，西藏 林芝 860000）

腸球菌屬細菌為G+球菌，常成對或短鏈，腸球菌屬有糞腸球菌、屎腸球菌等19種。作為人和動物腸道的正常菌群，一般情況下腸球菌并不引起疾病，但在人或動物機體抵抗能力不強的情況下，它就會成為條件致病菌引起人或動物機體患病。此外，由于腸球菌的固有耐藥性以及因人類對抗生素的濫用獲得性耐藥性的產生，腸球菌對于抗生素的耐藥情況愈發嚴重[1]。本次試驗對從西藏山南地區采集到病死牦牛肝臟上分離到的試驗菌株進行細菌分離鑒定耐藥性檢測，將為西藏自治區細菌耐藥性檢測以及山南地區牦牛養殖和臨床用藥提供一定指導。同時，本次試驗利用枯草芽孢桿菌替代傳統抗生素來治療糞腸球菌導致的腹瀉，將為解決糞腸球菌臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源 對西藏山南地區一頭病死牦牛進行尸體剖檢，無菌采集牦牛肝臟放入密封袋中，置于冰盒后迅速送往試驗室，-20℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要試劑 營養肉湯、普通瓊脂、麥康凱培養基、綿羊血液、生化鑒定管（購自杭州濱河微生物試劑公司）、2×Es Taq MasterMix（Dye）、細菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE、Maker、核酸染料（購自武漢擎科創新生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器 恒溫培養箱、搖床、烘箱、超凈工作臺、PCR儀、凝膠成像系統、普通光學顯微鏡、電泳儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的分離 將病料充分研磨后離心，采集上清接種于普通營養肉湯，37℃搖床80r/min培養24 h。勾取菌液劃線接種于5%血瓊脂平板，37℃恒溫培養箱培養24 h。勾取典型單菌落再次接種于營養肉湯，37℃搖床80r/min培養24 h后進行革蘭氏染色鏡檢。將菌液劃線接種于普通瓊脂平板和麥康凱培養基進行純化，將典型單菌落接種于肉湯培養24 h后，50%甘油菌液以1：1的比例保菌，并將該菌株命名為BYP。

1.2.2 生化鑒定 用移液槍吸取純化后菌液20 ul接種于葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇、硫化氫、枸櫞酸鹽、硝酸鹽（還原）生化鑒定管，37℃培養24 h后觀察顏色變化對結果進行判定。

1.2.3 PCR鑒定 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌模板DNA，保存于-20℃；使用細菌16S rRNA通用性引物，27F-/1492R（合成自武漢擎科創新科技公司）。PCR反應體系為25ul，其中2×Es Taq MasterMix（Dye）12.5ul、上游引物1ul、下游引物1ul、細菌模板DNA 1ul、ddH2O 9.5ul配足體系；反應條件：94℃預變性1min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環，最后72℃延伸5 min[3]。

PCR擴增結束之后將產物產物于1%瓊脂糖中進行瓊脂凝膠電泳，之后于凝膠成像系統300 nm下觀察電泳情況并采集圖片。

1.2.4 DNA序列分析 PCR擴增產物送往武漢生工網點進行雙向測通，測序拼接結果經BLAST進行比對，并使用MegAlign軟件將測序結果與GenBank下載序列進行同源性分析，并用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 藥敏試驗 吸取200 ul細菌24 h純培養菌液移到普通瓊脂上面，并使用無菌涂布棒將菌液涂布均勻，最后棄去多余菌液，使用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼于平皿中，輕輕下壓藥敏紙片，同時注意藥敏紙片之間的距離適當，培養基在37℃恒溫培養箱培養24 h后，使用游標卡尺測量抑菌圈直徑，依據藥敏試驗標準對藥敏結果進行判定[2]。

1.2.6 動物試驗 從林芝市農貿市場購置健康家兔4只，將其隨機分成2組，一組為試驗組，一組為對照組。正常飼喂一段時間，周期為兩周。在此期間，保持兔舍衛生狀況、通風良好，飼料、飲水充足。兩周之后，將腸球菌BYP經37℃恒溫搖床培養8h后的菌液對4只家兔進行腹腔注射，菌液濃度為2.7×109cfu/ml，5 ml/只，1次/d，連續注射4d[5]。在四只兔子出現腹瀉現象時，對試驗組家兔灌服試驗室保存的一株耐酸耐膽鹽的枯草芽孢桿菌[7]，灌服劑量均為20 ml/只，1次/d，連續給藥7d。對照組家兔不予處理。在此期間應及時對兔子進行觀察并記錄。

2 結果

2.1 細菌的分離培養

初次將增殖后的菌液劃線接種于5%血瓊脂平板后有輕微溶血現象；在麥康凱培養基上可形成粉紅色小菌落；在5%血清瓊脂平板上生長良好。革蘭氏染色鏡檢可見藍紫色革蘭氏陽性球菌，常成對，也可見單個分布或鏈狀排列，無芽孢（圖1）。

圖1 細菌鏡檢結果（100×10）

2.2 生化試驗結果

生化試驗結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖，甘露醇，硫化氫、枸櫞酸鹽、硝酸鹽（還原）均呈陰性（表1）。

表1 細菌生化試驗結果

2.3 PCR鑒定

PCR擴增產物經1%瓊脂凝膠電泳后，于凝膠成像系統300nm下對圖像進行掃描，可以清楚看到16S rDNA擴增產物為1.5kb左右的條帶，于預期片段大小結果相符（圖2），說明細菌的16S rDNA序列被成功擴增[4]。

圖2 BYP 16S rDNA PCR產物電泳結果

2.4 DNA序列分析

此次16S rDNA PCR擴增產物測序方式為雙向測通，測序結果出來后使用chromas軟件對序列進行拼接，拼接后序列長度為1 464 bp，與預期相符，使用MegAlign將序列進行同源性分析，如圖3所示，菌株BYP與登錄號為NR_113257、NR_113900、NR_036922、NR_075022、NR_113574、NR_113256、NR_037082、NR_114742、NR_114452的序列的同源性均在99.0%以上，可以認定它們為同一物種，即可以確定菌株BYP屬于腸球菌屬[4]。同時由圖4所構建的菌株BYP的系統發育樹可以看出，所分離到的腸球菌BYP與登錄號為NR_075022的菌株屬同一支，即親緣關系最近。

圖3 BYP 16S rDNA基因序列同源性

圖4 BYP 16S rDNA序列系統進化樹

表2 西藏牦牛源腸球菌藥物敏感性試驗結果

2.5 藥敏試驗結果

通過測量抑菌圈直徑大小并依據CNSL標準進行判定，發現該菌株對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬古霉素表現出敏感，對氨芐西林、苯唑西林表現出耐藥（表2）。

2.6 動物試驗

對家兔進行腹腔注射腸球菌4天后，四只家兔均出現腹瀉現象，精神沉郁、食欲寡歡、被毛粗亂。對照組兔子不予處理，七天后均死亡，死后對其進行尸體剖檢，發現其腸道出現充血現象，腸系膜一扯就破，肝臟輕微腫大，形體極度消瘦。試驗組兔子灌服枯草芽孢桿菌后，漸漸好轉，腹瀉現象消失恢復健康。說明枯草芽孢桿菌對于治療腸球菌所導致的家兔腹瀉有治療效果[6]。

3 討論與分析

本次試驗通過對從西藏山南地區病死牦牛肝臟中分離到的一株病原菌進行生化鑒定，16S rDNA進行測序，證明所分離到該株病原菌為屬于腸球菌屬。但是由于屎腸球菌菌群各種細菌16S rDNA序列同源性處于98.7%～99.7%之間，所以BYP屬于何種還需通過種特異性引物的PCR實驗進行確定[7]。

藥敏試驗結果顯示該菌株對，對氨芐西林、苯唑西林表現出固有耐藥性，而對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、阿莫西林青霉素G、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、紅霉素、萬古霉素表現出敏感。在此試驗中，盡管腸球菌對慶大霉素和卡那霉素十分敏感，但在臨床上無效。除非做氨基糖苷類藥物的高濃度篩選。

近年來隨著抗生素的濫用以及細菌之間耐藥基因轉移，西藏地區細菌耐藥性情況日益加重[8]，探求細菌耐藥機制以及解決方法成為熱點，因而尋找出一種防止細菌產生耐藥性的治療方法變得尤為重要。而益生菌就成為了一種好的選擇。本次動物試驗中對健康家兔使用BYP進行攻毒試驗使其腹瀉，再使用一株耐酸耐膽鹽的枯草芽孢桿菌替代抗生素來治療家兔腹瀉，治療效果良好。證明枯草芽孢桿菌在一定程度上可以作為臨床上抗生素的替代品。這就避免了由于使用抗生素或可能產生的耐藥性問題，為今后腸球菌治療提供了新思路。