鹽酸戊乙奎醚與右美托咪定在內毒素致大鼠急性肺損傷的保護性作用比較*

孟志鵬，劉 靜，胡四平，童 飛，龔浩杰

(1.浙江省湖州市中心醫院麻醉科 313000；2.浙江省湖州市婦幼保健院麻醉科 313000)

膿毒癥可導致全身多器官損傷，而肺臟因其獨特的結構與功能，成為最早、最易受累且病情最重的器官之一[1]，常表現為高病死率的急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等危重癥，炎性反應失衡是ALI的根本原因之一，盡管學者們對ALI的防治及肺保護研究已取得巨大進展，但其病死率仍高達30%～40%[2]，臨床亟須尋求膿毒癥肺損傷的預防方案和治療藥物。右美托咪定(DEX)是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，研究證實DEX因具有抗氧化、抗炎等獨特作用能減輕大鼠急性肺損傷[3]，特別是在膿毒癥患者ALI呼吸機支持治療時能減輕呼吸機相關性肺損傷或腎缺血再灌注肺損傷[4-5]。近年來，隨著對祖國醫學的重視及對ALI/ARDS的不斷研究，有學者發現我國自主研發的傳統醫藥鹽酸戊乙奎醚(PHC)因作用于支氣管平滑肌和肺組織M1、M3受體，使支氣管平滑肌痙攣得到解除，肺順應性增加，肺通氣得到改善，同時PHC是一種高選擇性的新型抗膽堿藥物[6]，能夠穩定各種細胞器的膜結構，降低毛細血管通透性，緩解急性微循環功能障礙，還能抑制呼吸道腺體分泌，降低分泌物對肺部的感染，從而減輕肺組織損傷[7]，也有研究表明PHC抑制Toll樣受體-4表達，抑制大量炎性因子在肺內聚集和浸潤，減輕肺部炎性反應，發揮一定的肺保護作用[8]。本研究通過比較PHC與右美托咪定對內毒素脂多糖(LPS)致大鼠ALI的保護性作用，探討PHC臨床治療ALI的理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年雄性健康清潔級SD大鼠40只，8周齡，體質量250～300g，由浙江省醫學科學院動物實驗中心提供[動物使用許可證號：SYXK(浙)2014-0001]，分組分籠每籠3～4只，安靜環境、室溫22～24 ℃下適應性喂養1周，自由飲食、飲水，模擬晝夜交替12 h。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組 術前大鼠自由飲水，禁食12 h。腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg麻醉后，仰臥位固定于操作臺上稱重，行右股靜脈、右頸內動脈穿刺、置管。術中保留自主呼吸。按隨機數字表法將大鼠分為4組，每組10只。(1)LPS模型組(LPS組)：右股靜脈注射LPS(Escherichia coli O111:B4，美國 Sigma公司)6 mg/kg；(2)DEX治療組(L+D組)：LPS作用30 min后2 min內右股靜脈注射DEX 50 μg/kg(江蘇恒瑞醫藥公司，批號：16060132)，隨后以5 μg·kg-1·h-1微泵泵入；(3)PHC治療組(L+P組)：LPS作用30 min后2 min內右股靜脈注射PHC 1 mg/kg(成都力思特制藥股份有限公司，批號：H20080606)，隨后以1 μg·kg-1·h-1微泵泵入。(4)0.9%生理鹽水對照組(對照組)：經右股靜脈給予等量0.9%生理鹽水。

1.2.2標本采集與標本檢測 注射0.9%生理鹽水或LPS 6 h后，右頸動脈采血2 mL后放血處死，血標本用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-1β及IL-6水平。取右肺上葉5 mm×5 mm組織，甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片(厚度約5 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下行肺組織病理學檢查，并從中性粒細胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔內出血、肺泡腔滲出4個方面按嚴重程度行彌漫性肺泡損傷標準(DAD)評分：正常為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分[9]；取右肺中葉組織，濾紙吸盡表面水分及血液，稱濕重(W)，然后置80 ℃電熱干燥箱內烘烤24 h左右，待質量恒定后稱干重(D)，計算肺組織濕/干重(W/D)比值。分離氣管，夾閉右支氣管，分3次用4 ℃ 0.9%生理鹽水按20 mL/kg行左支氣管肺泡灌洗，并回收左支氣管肺泡灌洗液(BALF)，離心后用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定BALF的TNF-α、IL-6水平，用二喹啉甲酸(BCA)法測定BALF中總蛋白(TP)水平。

2 結 果

2.14組血清炎性因子水平比較 與對照組比較，LPS組、L+D組、L+P組炎性因子水平升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個治療組TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯下降(P<0.05)；L+P組與L+D組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組血清炎性因子水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

2.2光鏡下觀察肺組織病理學改變 光鏡下，對照組中性粒細胞聚集、浸潤少，肺組織結構無明顯損傷(圖1A)；LPS組可見大量以中性粒細胞為主的炎性細胞聚集、浸潤，肺泡結構紊亂，破壞嚴重，肺泡間隔水腫、增寬明顯，肺泡腔大量滲出且伴有明顯出血(圖1B)；L+D組、L+P組肺組織損傷程度較LPS組輕，病理學改變程度較LPS組輕，L+D組與L+P組比較無明顯差異(圖1C、D)。

2.34組肺組織DAD評分和W/D比值比較 與對照組比較，其余3組DAD評分及W/D比值均明顯升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個治療組DAD評分及W/D比值均明顯下降(P<0.05)；L+P組與L+D組DAD評分及W/D比值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

A：對照組；B：LPS組；C：L+D組；D：L+P組

圖1各組肺組織病理學改變(HE染色，×200)

表2 各組DAD評分和肺組織W/D比值比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

2.44組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平比較 與對照組比較，其余3組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平明顯升高(P<0.05)；與LPS組比較，兩個治療組TNF-α、IL-6和TP水平均下降(P<0.05)；L+P組與L+D組BALF中TNF-α、IL-6和TP水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組BALF中TNF-α、IL-6和TP表達水平比較

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與LPS組比較

3 討 論

通過實驗，筆者發現靜脈注射DEX、PHC對LPS導致的大鼠ALI有保護作用。DEX、PHC注射可以顯著降低大鼠血清中炎性因子水平、BALF中炎性因子及TP水平，減輕由于LPS導致的肺部水腫損傷。DEX、PHC 可以通過抗炎對LPS導致的ALI起到早期保護作用。膿毒癥是臨床工作中常見的一種急危重癥，常引起全身多器官損傷，其中肺損傷病情重，發生早，常表現為ALI或者ARDS，是導致患者病死率居高不下的主要原因[10]。革蘭陰性菌細胞壁的主要成分是LPS，是引起膿毒癥性ALI的重要物質，LPS水平與膿毒癥性ALI密切相關，因此，本實驗選擇股靜脈注射6 mg/kg LPS制備大鼠ALI模型[11]。筆者發現大鼠經LPS處理后，HE染色和光鏡下顯示出顯著特征性肺組織病理學改變，包括大量中性粒細胞浸潤、肺泡壁變薄、肺泡腔內液體滲出、出血，肺組織DAD評分升高、W/D比值顯著升高，BALF中炎性細胞數量增多，TP水平明顯升高等特征，表明制備大鼠ALI模型成功。

ALI的發病機制為肺部炎性反應，也是ALI的中心環節。肺組織內的炎性因子、趨化因子被激活后產生級聯免疫反應。研究表明TNF-α、IL-6和IL-1β是ALI早期炎性反應中較早升高的炎性因子，也作為ALI時炎癥介質的始動因素誘發多種炎性因子的表達，并在ALI的進展中起到了重要作用[12]。其中，TNF-α是應激反應中最早產生的促炎因子，在ALI發生、發展中起到核心作用[13]。IL-1β是由單核巨噬細胞產生的一種多功能促炎因子，大量聚集、浸潤于ALI肺泡液中，誘導早期蛋白的合成，在ALI的發生、發展中起到促進作用；IL-6是由單核巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞產生的炎性因子，與TNF-α協同作用于ALI的進程中，可比較準確地反映肺組織的炎性反應強度，其表達水平與ALI嚴重程度密切相關。其表達與ALI輕重程度一致[14]。因此，抑制炎性反應是減輕LPS致ALI的有效方法之一。

DEX是一種新型高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，因具有鎮痛、鎮靜、催眠、不抑制呼吸等獨特的優點被廣泛應用于臨床。張琳等[15]研究發現，膿毒癥大鼠經DEX處理后炎性因子釋放被抑制，炎性反應程度減輕，膿毒癥大鼠的死亡率大大降低。隨著研究的深入，發現DEX可以增加抗炎因子的表達，抑制中性粒細胞的浸潤，對腦、心、肺、腎等重要臟器具有一定的保護作用，其中，DEX的肺保護作用逐漸得到臨床研究者的重視[16]。

肺部組織中富含大量的M1、M3膽堿能受體，而PHC是一種新型抗膽堿藥，選擇性作用于M1、M3受體，減少腺體分泌，降低氣道阻力，增加肺順應性，解除支氣管平滑肌和肺毛細血管痙攣，減輕肺水腫，改善肺功能。此外，PHC還能穩定細胞膜及溶酶體、線粒體等細胞器的膜結構，抑制 TNF-α、IL-6等促炎因子釋放，減輕炎性反應[8]。

本實驗中大鼠靜脈注射LPS后，血清和BALF中上述炎性因子水平均有不同程度升高，出現明顯的炎性反應。說明LPS打破了大鼠體內的促炎和抗炎動態平衡，炎性因子過度表達并向失控方向發展。TNF-α、IL-6和IL-1β大量生成和釋放。給予DEX或PHC治療后，血清和BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β明顯降低，表明二者的干預可以抑制膿毒癥大鼠炎性因子的釋放，減輕炎性細胞的浸潤，緩解LPS導致的肺組織炎性反應，且二者治療效果沒有明顯差異。本實驗結果還表明，大鼠經LPS干擾后，光鏡下肺組織病理學改變提示肺組織出現不定程度的損傷，肺組織DAD評分、W/D比值及BALF中的TP均有升高，給予DEX或PHC干預后，光鏡下觀察病理切片結果提示肺損傷情況較LPS組有明顯好轉，肺組織DAD評分、W/D比值及BALF中TP水平出現下降，表明肺泡水腫程度經DEX或PHC治療后得到明顯改善，二者對LPS致ALI具有一定的保護作用，且二者療效無明顯差異。

綜上所述，本實驗證明了DEX和PHC均可通過抗炎作用從而有效減輕肺組織的級聯炎性反應及肺泡水腫程度，對LPS致大鼠早期ALI有一定的保護作用。但是本研究發現二者在明顯抑制炎性因子表達的情況下，ALI只是減輕，未全部緩解，推測ALI仍存在DEX和PHC作用以外的分子機制。其他可能的分子機制及二者能否改善ALI大鼠的最終預后有待進一步研究證實。