HPLC測定液體制劑中維生素K1含量的方法學驗證

王亞男

摘 ?要：目的 建立液體制劑中膠束型維生素K1的含量測定方法。方法 采用Ultimate XB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×150mm），乙醇：水（9∶1）作為流動相，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為269nm，進樣量為20uL。結果 維生素K1濃度在20.04～200.8ug/mL這之間線性關系良好。平均回收率為99.95%，RSD為1.05%。結論 該檢測方法準確、方便，可以作為液體制劑中維生素K1含量測定的方法。

關鍵詞：HPLC ?膠束 ?液體制劑 ?維生素K1 ?方法學驗證

中圖分類號：R927 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）07（a）-0251-02

維生素K1主要用于治療體內缺少維生素K1從而出現內臟等出血現象的病癥，VK1目前基本上藥物應用劃分在止血藥物這一領域，臨床上主要以維生素K1注射液的形式給藥[1]。維生素K1不僅治療效果明顯，而且還具有藥價親民等優勢。然而維生素K1的溶解性較差限制了它的使用范圍，這一類藥物由于其溶解度都很低從而也導致了其生物利用度在很大程度上大打折扣，從而限制了這一類難溶性藥物在臨床應用領域的發展[2]。隨著藥劑學的不斷發展，并且通過搜索國外目前市售新型的維生素K1注射液新劑型，我們發現磷脂膽鹽膠束作為增溶系統中的一種，可以非常明顯地提高該類藥物的水溶性[3]，并且幾乎對人體不會產生毒副效應。膠束型維生素K1注射液在國外臨床上已經應用多年，是非常優良的難溶性藥物的增溶載體。該研究主要就是對磷脂膠束中維生素K1含量測定[4]的高效液相色譜方法進行方法學驗證，為后期開發該類產品提供科學有效的研究依據。

1 ?材料和儀器

1.1 材料

維生素K1原料藥（山東廣通寶醫藥有限公司）;蛋黃卵磷脂（含量約為80%，日本丘比株式會社）;膽酸鈉（重慶卡蘭醫藥有限公司）;鹽酸（德州邁化）;氫氧化鈉（德州邁化）;乙醇（色譜級，Fisher）。

1.2 儀器

萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）;LC-2010 型高效液相色譜儀（島津，日本）;數控超聲水浴鍋（江蘇盛藍儀器公司）;恒溫鼓風干燥箱 （型號：YP-250SDP上海邁捷儀器有限公司）;pH計（型號：STF5000/F，OHAUS/奧豪斯，美國）。

2 ?方法與結果

2.1 溶液的配制

（1）標準溶液配制。準確稱取維生素K1原料藥10.1mg，膽酸鈉54.2mg，磷脂53.9mg，加流動相溶解定容，配制為5.01mg/mL的維生素K1樣品貯備液。

（2）供試品溶液配制。準確稱取處方量的磷脂及維生素K1，加入適量的三氯甲烷溶解，減壓蒸餾，蒸干成膜后，緩慢加入適量注射用水，震蕩溶解，水浴超聲45min。將超聲后的溶液過濾，去濾液，即得維生素K1磷脂膽鹽膠束溶液。

2.2 含量測定方法學驗證

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18色譜柱（5μm， 4.6mm×150mm）;流動相：乙醇∶水（9∶1）;檢測波長：269nm;柱溫：30℃;流速：1.0mL·min-1;進樣量：20uL。并且以上HPLC條件，理論塔板數用維生素K1計要不小于2000，另外，藥物與相鄰雜質之間的分離度要符合要求。

2.2.2 系統適應性試驗

取維生素K1待測溶液，按照2.2.1項下的含量測定方法用高效液相色譜儀進樣測定，實驗結果說明該流動相乙醇∶水（9∶1）下的峰型對稱度良好，且與雜質和溶劑在這個系統條件下的分離度較優。

2.2.3 空白輔料干擾實驗

準確稱取磷脂和膽酸鈉，即空白輔料，加入乙醇稀釋定容，作為輔料溶液，配制成與樣品測定濃度相同的空白輔料溶液，分別按照2.2.1項下的含量測定方法進樣測定，經過檢測結果圖譜對比，可見輔料在維生素K1主峰位置處以及周圍無色譜峰，因此輔料對維生素K1主藥的測定沒有干擾。

2.2.4 線性試驗

準確稱取維生素K1原料藥10.1mg，甘氨膽酸鈉54.2mg，磷脂53.9mg，加流動相溶解定容，配制為5.01mg/mL的維生素K1樣品貯備液。精密量取上述溶液，加乙醇將維生素K1貯備液分別定量作20.04ug/mL，60.03ug/mL，80.02ug/mL，101.3ug/mL，120.9ug/mL，141.4ug/mL，200.8ug/mL，一系列標準溶液。在上述HPLC方法條件下測定，對主峰面積A和濃度C用Excel軟件計算，從而計算結果得到標準曲線方程。

得出實驗結果：維生素K1的濃度在20.04～200.8ug·mL-1范圍時的線性方程為A=210149C-13064，相關系數R2=0.999，由此得出結論，進樣量在20uL時，維生素K1濃度范圍在20.04～200.8mg/mL內線性關系良好。

2.2.5 準確度

準確稱取維生素K1原料藥，依法配制成測試濃度的80%、100%、120%3個不同濃度的溶液作為待測溶液，3個濃度溶液各配制3份;另依照上述方法配置3個濃度的標準溶液，共計9份溶液。取上述供試品溶液和對照品溶液分別進樣，記錄HPLC色譜圖，計算實驗結果。

得出實驗結果：在3個不同濃度下的回收率分別都在98.0%～102.0%之間，計算得出的平均回收率是100.01%，RSD%是0.18%，說明該實驗所采用的方法具有良好的回收率，準確度符合規定。

2.2.6 定量限和檢測限

準確稱取維生素K1，用乙醇溶解維生素K1稀釋制成100mg/mL溶液，作為檢測限和定量限測定時備用的貯備液。分別對上述溶液用乙醇稀釋，進樣檢測，當S/N約10時測定結果定為定量限，定量限濃度為120ng·mL-1，連續進樣6針;當S/N約3時，結果得到的檢測限濃度為20ng/mL。

試驗結果：定量限連續6針的峰面積相對標準差1.01%，小于2.0%，符合試驗的要求，檢測限為0.4ng，說明該方法的檢測靈敏度較高。

2.2.7 精密度

（1）檢測儀器精密度。取VK1對照品溶液100ug/mL，取該樣品進樣，連續進樣6針，進行含量測定并計算，結果表明：平均峰面積計算得出的結果是2592423.7，RSD是0.19%，其結果RSD<2.0%，說明該方法的進樣精密度好。

（2）重復性。準確稱得維生素K1，用乙醇稀釋溶解定容，配制對照品6份，同時配置供試品6份，按照上述方法進行試驗，結果表明：經考察后，供試品的平均含量為99.59%，測得RSD為0.73%，符合要求的RSD小于2.0%，說明該實驗方法的中間精密度良好。

2.2.8 溶液穩定性

準確稱取維生素K1，用乙醇稀釋定容，制備待測貯備液。取維生素K1貯備液，配置成100ug/mL的供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8h，測定供試品溶液的含量，考察維生素K1混合膠束溶液的穩定性。由以上結果可知：維生素K1混合膠束溶液在室溫條件下放置8h均穩定，滿足穩定性實驗測定的要求。

3 ?結語

綜合上述實驗結果表明：空白輔料對維生素K1膠束型液體制劑的含量測定無干擾;測得線性、精密度（其中包括重復性和中間精密度）、定量限、檢測限、回收率均符合方法要求，并且溶液在室溫條件下放置8h，測定后的結果均穩定。因此，該方法可以應用于維生素K1膠束型液體制劑中維生素K1的含量測定，為后期維生素K1注射液新劑型（磷脂膽鹽膠束）的研究奠定基礎。

參考文獻

[1] 孟新芳，曹永孝，劉海靜.對維生素K1注射液不良反應的思考[J].學爭鳴，2012（6）：44-46.

[2] 張勇，陳玉威，高桂花.HPLC法測定多維元素片（29）中維生素K1的含量[J].實用藥物與臨床，2007，10（3）：189-190.

[3] 姜瑞清，周琳，胡桂林，等.對GB 5413.10-2010中維生素K1檢測的改進研究[J].中國乳品工業，2011，39（9）：50-52.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：623-625.