非小細(xì)胞肺癌患者外周血ctDNA中EGFR基因突變檢測的臨床意義

陳學(xué)瑜，羅芳秀，趙廣垠，朱良綱

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院，上海201801)

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年其發(fā)病率與病死率有逐漸增高趨勢。我國肺癌發(fā)病率5.88/萬人，預(yù)后差，5年生存率僅為20.99%[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，目前其尚缺乏有效的早期篩查手段，發(fā)現(xiàn)時(shí)患者多為晚期，并已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2],常規(guī)放化療效果不佳。研究表明，NSCLC組織中表皮生長因子受體(EGFR)外顯子19缺失及外顯子21 L858R置換突變時(shí)，予以分子靶向藥物如EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療，能有效縮小病灶，延長患者生存時(shí)間，提高患者生活質(zhì)量[3]。但由于晚期NSCLC患者缺乏手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本，并且纖維支氣管鏡、經(jīng)皮肺穿刺活檢等手段獲取的腫瘤組織有限，難以根據(jù)EGFR基因突變情況選擇是否予以TKI治療[4]。近年來隨著新的診斷技術(shù)的發(fā)展，可檢測患者外周血來源于腫瘤的游離DNA(ctDNA)中EGFR基因突變，其敏感性、特異性及穩(wěn)定性較高[5]。本研究檢測NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突變，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年2月～2018年2月本院診治的晚期NSCLC患者77例，男46例，女31例；年齡37～81(58.2±7.3)歲；肺腺癌59例，肺鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)18例；有吸煙史29例；漢族72例；腫瘤分期[6]均為Ⅳ期；美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)體能狀態(tài)評(píng)分：0～1分55例，≥2分22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查確診為NSCLC；年齡≥18歲；治療前未接受其他抗腫瘤治療；具有至少1個(gè)可評(píng)價(jià)的腫瘤病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整；伴其他惡性腫瘤、急性傳染病；收集的血液樣本量不足或被污染；伴明顯的心、肝、腎等臟器功能損害。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 治療方法與療效評(píng)價(jià) 患者均予以TKI治療，TKI藥物種類根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇，吉非替尼250 mg口服，1次/d；厄洛替尼150 mg口服，1次/d。治療期間密切監(jiān)測患者血尿常規(guī)、肝腎功能，并做心電圖檢查，直至出現(xiàn)嚴(yán)重的患者不能耐受的不良反應(yīng)，或出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移停止治療。采用實(shí)體瘤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行近期療效評(píng)價(jià)[7]，完全緩解(CR)：全部病灶已消失；部分緩解(PR)：腫瘤灶最大徑縮小>30%；穩(wěn)定(SD)：腫瘤灶最大徑變化20%～30%；疾病進(jìn)展(PD)：腫瘤灶最大徑增大>30%或出現(xiàn)新病灶。客觀緩解率(ORR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)×100%，疾病控制率(DCR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù)+SD例數(shù))/總例數(shù)×100%。無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)為自開始口服藥物治療到出現(xiàn)疾病進(jìn)展或死亡的時(shí)間。用藥后1個(gè)月評(píng)價(jià)療效，之后每3個(gè)月復(fù)查1次，隨訪方式為門診或電話隨訪，隨訪截止至2018年3月。

1.3 外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變檢測 TKI治療前用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)法(ARMS)檢測患者外周血ctDNA中EGFR基因突變情況。患者禁食8 h后采集清晨空腹靜脈血10 mL，置于EDTA抗凝管中室溫下2 000 g離心10 min分離上清液，8 000 g離心10 min分離血漿，取上清液置于離心管中保存于-80 ℃冰箱中待測。應(yīng)用血漿游離DNA分離試劑盒(艾德生物公司)提取患者血漿游離DNA，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。應(yīng)用NanoDrop 2000核酸定量測定儀對(duì)DNA的濃度進(jìn)行定量測定，吸光度(OD)260與OD280比值為1.8～2.0。應(yīng)用ARMS在熒光定量PCR儀上對(duì)外周血ctDNA中EGFR基因突變進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒(艾德生物公司)說明書進(jìn)行操作。同時(shí)對(duì)腫瘤組織中EGFR基因突變進(jìn)行檢測，樣本均為甲醛固定石蠟包埋的標(biāo)本，每個(gè)樣本切片8張，應(yīng)用DNA提取試劑盒提取DNA(廈門艾德生物公司)，測定濃度后保存于-20 ℃冰箱中，ARMS檢測步驟同上。突變結(jié)果根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行判定，基因突變含量>1%，突變Ct值≥29判定為基因突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2或Fisher確切概率法。Kaplan-Meier生存分析(Log-rank檢驗(yàn))基因突變與患者生存預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變比較 外周血ctDNA中EGFR基因野生型46例，突變型31例，其中外顯子19缺失突變型16例、外顯子21 L858R錯(cuò)義突變型12例、外顯子20 T790M突變型3例。腫瘤組織中EGFR基因突變33例(42.9%)，其中外顯子19缺失突變型14例、外顯子21 L858R錯(cuò)義突變型16例、外顯子20 T790M突變型3例。外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.744)，二者EGFR基因突變位點(diǎn)分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.814)。

2.2 外周血ctDNA中EGFR基因突變與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腺癌患者的EGFR基因突變率高于鱗癌患者，不吸煙患者的EGFR基因突變率高于吸煙患者(P均<0.05)；外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者年齡、性別、民族及ECOG評(píng)分無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 外周血ctDNA中EGFR基因突變與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 外周血ctDNA中EGFR基因突變與近期療效及預(yù)后的關(guān)系 77例患者中，CR 0例、PR 31例、SD 29例、PD 17例。不良反應(yīng)均為1、2級(jí)腹瀉與皮疹，未發(fā)生3、4級(jí)不良反應(yīng)，無患者因嚴(yán)重不良反應(yīng)退組或減少用藥劑量。外周血ctDNA中EGFR基因突變型患者CR 0例、PR 19例、SD 10例、PD 2例，ORR 19例(61.3%)，DCR 29例(93.5%)；野生型患者CR 0例、PR 12例、SD 19例、PD 15例，ORR 12例(26.1%)，DCR 31例(67.4%)。外周血ctDNA中EGFR基因突變型患者ORR、DCR均高于野生型患者(P均<0.05)。至隨訪結(jié)束，共51例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展或死亡，外周血ctDNA中EGFR基因突變型和野生型患者中位PFS分別為9、4個(gè)月，突變型患者中位PFS長于野生型患者(P=0.022)。

3 討論

NSCLC的傳統(tǒng)治療方法是以鉑類為基礎(chǔ)的多周期化療，但毒性反應(yīng)限制了化療的臨床應(yīng)用。近年來隨著針對(duì)不同生物靶點(diǎn)的靶向藥物的出現(xiàn)，如TKI、針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子受體的單克隆抗體等，患者長期生存和預(yù)后有所改善。EGFR是一種含486個(gè)氨基酸受體蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約170 kD，其結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)，是第1個(gè)被鑒定為與表皮生長因子結(jié)合的具有酪氨酸激酶活性的受體。EGFR的磷酸化對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重要作用，參與了肺癌、胃癌、胰腺癌及腎癌等多種不同類型腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展[8]。因此，EGFR已被認(rèn)為是癌癥治療的重要分子靶標(biāo)，并且已經(jīng)開發(fā)和研究了部分抗EGFR抑制劑，包括單克隆抗體或小分子TKI。目前美國食品藥品管理局批準(zhǔn)上市的TKI包括吉非替尼、厄洛替尼等，該類藥物與細(xì)胞毒類藥物相比，能延長EGFR陽性的NSCLC患者總體生存時(shí)間和PFS。NSCLC患者中EGFR基因突變狀態(tài)在EGFR-TKI的治療反應(yīng)中起重要作用。但10%～15%的NSCLC患者無法獲取足夠的腫瘤組織進(jìn)行分子檢測。

ctDNA是細(xì)胞壞死或凋亡后釋放入外周血的DNA，是來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA。外周血ctDNA水平可反映腫瘤組織中基因的突變狀態(tài)，但外周血中ctDNA水平低，很難被檢測到。隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，ARMS、液相色譜分析技術(shù)等可檢測到低水平的ctDNA。研究表明，與健康人群相比，NSCLC患者外周血ctDNA水平明顯升高，并且與原發(fā)腫瘤組織具有一致性[9]。本研究比較外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變情況，結(jié)果表明外周血ctDNA與腫瘤組織中EGFR基因突變具有較好的一致性。兩種標(biāo)本中EGFR基因突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且二者突變位點(diǎn)也較一致，結(jié)果與以往研究[10]一致。因此在無法獲取腫瘤組織時(shí)，檢測外周血ctDNA的EGFR基因突變可能是一種合理的替代方法。

本研究進(jìn)一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，外周血ctDNA中EGFR基因突變與腫瘤病理類型、患者吸煙史有關(guān)，腺癌的EGFR基因突變率高于鱗癌，不吸煙患者高于吸煙患者，而與年齡、性別、民族及ECOG評(píng)分無關(guān)。周建婭等[11]研究表明，NSCLC患者EGFR基因突變多見于腺癌、女性及不吸煙的患者。目前已明確吸煙是肺癌的重要病因，但不吸煙患者的EGFR基因突變率明顯升高，其機(jī)制尚不清楚，原因可能為吸煙與不吸煙患者腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制不同，涉及的驅(qū)動(dòng)基因和信號(hào)傳導(dǎo)通路也不同[12]。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中，肺腺癌患者的驅(qū)動(dòng)基因主要為TP53、KRAS及EGFR基因，而在肺鱗癌患者中，KRAS及EGFR基因突變較為少見[13]。本研究未發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變與性別有關(guān)，可能與樣本少有關(guān)，需多中心、大樣本進(jìn)一步深入研究。

近年來，雖然新的細(xì)胞毒藥物、免疫治療藥物等提高了抗癌的療效，但在延長患者的總體生存時(shí)間、PFS及生活質(zhì)量上，尚無滿意的結(jié)果。本研究進(jìn)一步研究外周血ctDNA中EGFR基因突變與患者近期療效的關(guān)系，結(jié)果表明外周血ctDNA中EGFR基因突變患者的ORR、DCR均高于野生型患者。研究表明，與標(biāo)準(zhǔn)化療相比，EGFR敏感突變的NSCLC患者應(yīng)用吉非替尼、厄洛替尼TKI治療的ORR較高[14]。EGFR基因的突變包括19外顯子缺失、21外顯子L858R突變及18外顯子的G719X突變，上述突變可引起野生型結(jié)構(gòu)中維持激酶非活性狀態(tài)的疏水殘基結(jié)構(gòu)的破壞，引起EGFR持續(xù)活化，因此予以TKI治療的有效率較高[15]。此外，本研究中ctDNA中EGFR基因突變型患者的中位PFS明顯優(yōu)于野生型患者，與以往報(bào)道[16]一致。因此，晚期NSCLC患者選擇治療方案之前，應(yīng)對(duì)EFGR的突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，從而對(duì)靶向治療效果進(jìn)行預(yù)測，以便選擇最優(yōu)的治療方案[17]。

綜上所述，在缺乏腫瘤組織標(biāo)本時(shí)，檢測NSCLC患者外周血ctDNA中EGFR基因突變是一種可行的替代方式，有助于治療方案的選擇及預(yù)后判斷。但本研究限于樣本較少，有待進(jìn)一步開展前瞻性、多中心、大樣本的臨床研究。