高寒草甸退化對優勢物種根際土壤微生物量及酶活性的影響

馬 源，張德罡，周 恒，周會程，陳建綱

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

過度放牧和人類不合理的開發利用使祁連山自然保護區大面積的高寒草甸發生了嚴重的退化，祁連山東緣作為人類活動的密集區，是整個祁連山區域退化最嚴重的高寒草甸地區之一。現今對于高寒草甸的恢復和對自然生態的保護已經成為眾多生態學家所關注的重點[1]，有研究報道，高寒草甸的退化主要是生態系統中能量流動和物質循環的不平衡造成[2]，而根際作為土壤-植物-微生物之間相互作用的界面，以及物質循環和能量交換的結點，不僅對土壤中養分轉化具有重要意義，而且對根際微生物的活性具有較強的影響[3-4]，因此，了解不同退化程度根際和非根際土壤微生物的多樣性以及土壤微生物的特征，對于研究草地退化過程中土壤養分的循環具有重要作用。

土壤微生物作為影響地球化學循環的重要因子，不僅對改變土壤理化性質和促進植物生長發育具有重要意義[5-6]。同時能夠作為土壤中養分的儲存庫參與土壤中的養分循環[7]。研究報道，土壤微生物生物量的多少與土壤的健康狀況具有密切關系，當土壤中微生物生物量的含量降低時，其微生物的活性越差，最終表現為土壤退化程度越高[8]。同樣，土壤中微生物生物量的高低也可作為檢測草地農業生態系統中物質循環能力強弱的指示性因子[9]。此外，土壤微生物對環境的變化非常敏感，有研究報道，不同退化程度的土壤，其微生物生物量的多少和微生物的活性強弱均有較大差異[10]。目前，大多數學者對草地退化的研究還集中在宏觀生態學方面，例如土壤理化特性、群落結構以及植被特性等方面，而從生理生態學角度來探究草地退化機理的研究則相對較少，尤其是退化程度不同的草地其根際中土壤微生物生物學特性的變化規律尚不明晰。而根際作為土壤中物質交換的強烈區域，在調控土壤pH，養分的周轉率和轉化，微生物的活性以及酶的活性等方面相比較非根際土壤更為靈敏[11]，因此，試驗通過對祁連山東緣4個不同退化程度的高寒草甸樣地(未退化草甸、輕度退化草甸、中度退化草甸、重度退化草甸)展開研究，分析不同退化程度的高寒草甸對優勢物種根際土壤和非根際土壤中3大類微生物數量，土壤微生物生物量的含量以及土壤酶活性的變化。為進一步了解草地退化對根際的影響，為高寒草甸恢復和重建提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣地概況

研究地點位于甘肅省祁連山東緣，地理位置E 102°44′11″～102°46′17″,N 37°11′42″～37°13′5″,其草地類型為寒溫潮濕高山草甸類，土壤類型為亞高山草甸土，山地黑鈣土，山地草甸土，土壤含水量在50%～80%，土壤pH 6.94～8.17，顯微堿性。海拔2 869.8～3 008.3 m,年均溫-0.1～0.6℃，全年≥0℃的積溫為1 360℃，年降水量4 46 mm，主要集中在7～9月，年均蒸發量1483～1 614 mm，氣候寒冷潮濕，水熱同期，平均相對濕度55%，年日照時間2 600 h[18]。主要植被包括珠芽蓼(Polygonumviviparum)、早熟禾(Poaannua)、披堿草(Elymusdahuricus)、線葉嵩(Carexcapillifolia)、矮嵩草(Kobresiahumilus)、甘肅棘豆(Oxytropiskansuensis)、唐松草(Thalictrumspp.)、委陵菜(Potentillaspp.)、鳳毛菊(Saussurreaspp.)、扁蓿豆(Melissilus ruthenicus)、乳白香青(Anaphalis lactea)、狼毒(Stellera chamaejasme)等(表1)。

表1 樣地概況

1.2 樣地設置與土壤樣品采集

根據《天然草地退化、沙化、鹽漬化的分級標準》(GB 19377-2003)[12]，于2018年8月在甘肅省天祝縣金強河草原站附近選取未退化草地(ND)，輕度退化草地(LD)，中度退化草地(MD)以及重度退化草地(SD)，每個樣地設50 m× 50 m的1個大樣方，并且在大樣方內通過S型取樣法，選取4個樣點，每個樣地為4個重復，在每個樣點里設置1 m×1 m的1個小樣方，用方格法測定每個小樣方中植物高度，植被蓋度，植物種類以及植物數量，以確定該退化梯度下的優勢植物。同時在小樣方內選取1個50 cm×50 cm的樣方用于采集地上生物量，最后在做樣方的地方分別挖取1個長寬高為0.15 m×0.15 m×0.20 m的土塊，用保鮮膜將土塊包好并做好標記，放入干冰箱中運回實驗室在無菌工作臺中進行土壤樣品的分離，包括根際土壤、非根際土壤以及用來測定土壤微生物生物量的土壤樣品。

試驗室內需將土壤進行處理，優勢植物根際土壤樣品的采集參考Chaudhary的抖落法[11]，將所挖取的完整土體進行分離(根系分布范圍內)，先輕柔抖落大塊不含根系的土壤，并通過人工手段取下附在根系周圍的土壤(5～10 mm)為非根際土(bulk soil，BS)，裝入自封袋中混勻。抖落之后仍粘在植物根系上的土壤(0～2 mm)為根際土壤(rhizosphere soil,RS)，用細毛刷收集裝入無菌自封袋中。根際土(RS)和非根際土(BS)分為兩部分，一部分保存為鮮樣，一部分自然陰干，用作土壤相關指標的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤微生物量碳、氮、磷及微生物活性的測定 土壤微生物量碳，氮，磷采用氯仿熏蒸法[13]。土壤微生物碳(MBC)采用高錳酸鉀硫酸外加熱法；土壤微生物氮(MBN)采用凱氏定氮法；土壤微生物磷(MBP)采用碳酸鈉浸提-鉬銻抗比色法，并計算土壤微生物量碳，氮和磷。

土壤微生物量碳(mg/kg)=(EC- EC0)/0.38

土壤微生物量氮(mg/kg)=(EN- EN0)/0.54

土壤微生物量磷(mg/kg)=(EP- EP0)/0.40

式中：EC，EN和EP分別為熏蒸土樣浸提液中碳，氮和磷的量；EC0，EN0和EP0分別為未熏蒸土樣浸提液中碳，氮和磷的量；校正系數分別是KC=0.38，KN=0.54和KP=0.4。

1.3.2 土壤微生物數量的測定 微生物真菌、細菌、放線菌采用平板涂抹法的方法測定[14]。真菌和放線菌在28℃培養5～8 d，細菌在30℃培養3 d，然后對每1個平板進行菌落計數，按稀釋倍數換算每克土的菌落總數。根際土壤和非根際土壤中真菌的數量采用馬丁·孟加拉紅瓊脂培養基；細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基；放線菌采用改良高氏1號培養基。

1.3.3 土壤理化性質的測定 土壤有機碳(SOC)，土壤全氮(TN)，土壤全磷(TP)的測定依照《土壤分析技術規范》的方法[15]；土壤速效磷(AP)參考張德罡等[16]高錳酸鉀氧化-葡萄糖還原法的測定方法；土壤pH用去CO2的蒸餾水(1∶2.5土水比的浸提液) 浸提后用pH 計測定[15]；土壤樣品中蔗糖酶(Invertase)、脲酶(UE)、過氧化氫酶(CAT)和蛋白酶(Protease)的活性使用蘇州科銘生物公司的試劑盒(土壤蔗糖酶(comin SSC-2-Y)、土壤脲酶(comin SUE-2-Y)、土壤過氧化氫酶(comin SCAT-2-Y)、土壤蛋白酶(comin SNPT-2-Y))進行測定。

1.4 數據統計與分析

群落多樣性計算[17]：

瑪格列夫指數：Ma=(S-1) /lnN

均勻度指數：E=H/lnS

式中：S為物種數；Pi表示第i個種在全體物種中的重要性比例，N為全部種的個體數。

研究采用SPSS 19.0進行數據分析，采用單因素法進行差異顯著性分析；利用Excel 2013進行數據整理；通過Origin 9.0進行圖表繪制，利用R(3.5.1)語言做雙變量相關分析。

2 結果與分析

2.1 不同退化程度高寒草甸植物特征和土壤理化性質

祁連山東緣高寒草甸退化程度的加劇，從整體上分析，使植物群落類型在一定程度上發生了明顯的改變，從未退化草甸到重度退化草甸莎草科植物線葉嵩呈現逐漸消失的趨勢，而菊科植物乳白香青則表現出增加的趨勢，說明草地退化程度的加劇，使高寒草甸區植物可利用性降低。同時，植物群落蓋度由100%下降到32%，植物平均高度由20.87 cm降低到2.16 cm，表明高寒草甸區的退化在一定程度上使植物群落的光能利用率下降，最終使土壤的理化性質發生改變(表2)。

并對4個梯度高寒草甸植物群落進行α-多樣性分析可知，隨退化程度的加劇，Margalef指數呈逐漸降低的趨勢，Simpson多樣性指數呈先上升后降低的趨勢，Shannon-weiner指數和Pielou指數呈逐漸上升的趨勢(表3)。

表2 不同退化程度高寒草甸土壤理化性質

注：不同小寫字母表示同一退化程度根際土壤與非根際土壤理化性質間差異顯著(P<0.05)

表3 高寒草甸不同退化程度的植物多樣性

注：不同小寫字母表示同一退化程度根際土壤與非根際土壤理化性質間差異顯著(P<0.05)

對退化程度不同的高寒草甸土壤理化性質分析可知(表2)，草地退化程度的加劇，使土壤中SOC、TN、TP和AP的含量降低，SOC的含量從9.57降低至6.15 g/kg；TN的含量由4.84降低至1.77 g/kg；TP的含量由0.82下降至0.25 g/kg；AP的含量由22.8降低至14.24 mg/kg，且差異性顯著(P<0.05)。土壤pH則呈現逐漸升高的趨勢，由7.51上升至8.08，這表明高寒草甸的退化降低了土壤中養分的含量，同時土壤環境由中性向偏堿性性轉變。

2.2 不同退化程度高寒草甸土壤酶活性的特征

退化程度的加劇，導致非根際土壤中過氧化氫酶，脲酶以及蛋白酶的活性逐漸降低，變化分別為過氧化氫酶70.28～66.66 mg/(g·h)、脲酶812.01～442.79 μg/(g·d)、蛋白酶0.55～0.25 mg/(g·d)；同時，根際土壤中過氧化氫酶、脲酶以及蛋白酶的活性與非根際土壤中酶活性的變化趨勢一致，變化分別為過氧化氫酶77.66～72.32 mg/(g·h)、脲酶912.49～576.69 μg/(g·d)、蛋白酶0.62～0.34 mg/(g·d)。根際土壤和非根際土壤中土壤蔗糖酶的含量在中度退化草甸中活性最高，為2.44 mg/(g·h)和2.12 mg/(g·h)。退化程度的加劇，導致根際和非根際土壤中脲酶和土壤蛋白酶的活性均表現為差異性顯著(P<0.05)。過氧化氫酶表現為在中度退化程度下根際和非根際土壤差異不顯著(P>0.05)，其他3個退化程度下差異顯著(P<0.05)。土壤蔗糖酶的活性在輕度退化程度下差異不顯著(P>0.05)，其他3個退化程度下差異性顯著(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同退化程高寒草甸根際與非根際土壤酶活性Fig.1 Rhizosphere and non-rhizosphere soil enzyme activities in different degraded alpine meadows注：不同小寫字母表示同一退化程度根際土壤與非根際土壤理化性質間差異顯著(P<0.05)

2.3 高寒草甸退化對土壤微生物數量的變化特征

祁連山東緣不同退化程度高寒草甸根際土壤和非根際土壤中3大類土壤微生物數量總體表現為細菌>放線菌>真菌(表4)。高寒草甸退化程度的加劇，使根際土壤和非根際土壤中真菌的數量表現為ND>LD>MD>LD，且數量變化范圍分別從4.12到1.74(×103cfu/g)，3.92到1.37(×103cfu/g)；根際土壤和非根際土壤中細菌的數量表現為ND>MD>LD>LD，數量變化范圍分別從2.05到0.55(×106cfu/g)，1.67到0.41(×103cfu/g)；根際土壤和非根際土壤中放線菌的數量表現為ND>LD>MD>LD，且數量變化范圍分別從1.73到0.37(×106cfu/g)，1.54到0.28(×106cfu/g)。并且在同一退化程度下根際與非根際土壤中真菌、細菌以及放線菌的數量均差異性顯著(P<0.05)。可見，根際土壤中3大類微生物的數量高于非根際土壤的微生物數量，說明根際區域微生物的活性更加強烈。

表4 不同退化程度高寒草甸土壤微生物數量

注：不同小寫字母表示同一退化程度根際土壤與非根際土壤微生物數量間差異顯著(P<0.05)，下同

2.4 不同退化程度高寒草甸土壤微生物生物量特征

退化程度的加劇，導致非根際土壤中MBC，MBN和MBP的含量逐漸降低，且變化分別為MBC 432.41～177.28 mg/kg，MBN 31.06～17.05 mg/kg，MBP 27.21～12.28 mg/kg；根際土壤中MBC和MBN的變化與非根際土壤保持一致，變化分別為：MBC 486.32～236.77 mg/kg，MBN 34.71～19.11 mg/kg，但根際土壤中的MBP的含量呈先下降后上升的趨勢，且變化為MBP 30.95～19.32 mg/kg，中度退化草甸中根際MBP的含量低于重度退化草甸中的MBP含量。同時，根際土壤和非根際土壤中MBC的含量差異性顯著(P<0.05)；MBN的含量在未退化和退化草甸中差異顯著(P<0.05)，但在中度退化和重度退化草甸中差異不顯著(P>0.05)；MBP的含量在4個不同退化程度下均為顯著性差異(P<0.05)(圖2)。

3 討論

3.1 高寒草甸退化對植物多樣性和土壤理化性質的影響

有研究報道當外界環境發生變化時將會導致生態系統中植物群落的多樣性發生改變[18]，同時，植物群落的變化必然會導致土壤中有機儲備的變化[19]，而土壤中有機物質的變化會促使土壤中微生物的組成和數量發生根本性變化[20]。因此，研究高寒草甸退化過程中優勢物種的變化趨勢，有助于進一步揭示植物與土壤微生物之間的相關性。試驗發現，隨高寒草甸退化程度的加劇，從未退化草地到重度退化草地，草地上植物物種數量呈逐漸降低的趨勢，并且優勢物種從以莎草科為主的線葉嵩逐漸變為以菊科為主的乳白香青，說明植物群落的類型發生了改變，與劉振國等[21]人的研究結論有相似性。研究發現隨著高度較高的線葉嵩和珠芽蓼等物種的退出，相對低矮的乳白香青和矮生嵩草逐漸增加，同時對不同退化程度草地進行樣方調查發現，隨退化程度的加劇草地群落的高度和蓋度呈現降低趨勢，這種變化是因為草地群落中優勢物種的改變導致植物群落的生產力發生了改變，與肖玉等[22]的研究具有相似的特性，隨著退化程度的加劇植物群落組分是植物群落結構和生產力變化的核心。

圖2 不同退化程高寒草甸根際與非根際土壤酶活性Fig.2 Rhizosphere and non-rhizosphere soil enzyme activities in different degraded alpine meadows

研究發現同一退化程度下，根際土壤中養分含量高于非根際土壤，并且根際土壤的pH高于非根際土壤的pH，這是因為根際過程在一定程度上提高了土壤中陰陽離子的交換能力，同時植物根系能夠分泌大量的有機酸，從而提高了H+的濃度。而在不同退化程度下發現，隨退化程度的加劇，根際和非根際土壤中pH均有一定程度的下降，是因為優勢物種發生變化，導致其根系分泌物的種類和數量發生變化而造成，需要做進一步的試驗和論證。有研究報道，植物的生長和發育對土壤中的養分含量起到重要的作用，并且土壤的養分狀況能夠正向的反應草甸的健康狀態，因此，土壤養分含量的多少能夠直接決定植物的生長優劣和植物的生產力強弱[23-25]。

土壤酶作為存在于土壤中的生物催化劑，是土壤系統最活躍的部分，能夠催化和激活土壤中難溶性的養分，使其變為易被植物吸收的狀態[26]，同時，土壤中微生物的活性和數量與土壤酶有直接關系[27]，因此，土壤酶是檢驗土壤質量和微生物活性的重要指標。試驗發現，隨退化程度的加劇，根際土壤和非根際土壤中4種酶的活性呈逐漸降低的趨勢，并且根際土壤中酶的活性高于非根際土壤中酶的活性(圖1)，說明在根際土壤中微生物的活性和數量遠遠高于非根際土壤，同時，根際養分含量高于非根際養分含量(表2)，進一步說明土壤養分的表聚效應[23]。這與李海云等[23]、劉江等[28]和胡雷等[29]的研究結果一致。在同一退化程度下由于根際土壤中微生物的活性較高、水熱條件和通氣性良好以及根系分泌物主要在根系表層富集，使得根際土壤酶的活性顯著高于非根際土壤。而隨著退化程度的加劇，由于外界環境和植物自身的原因限制了土壤中酶的活性。因此，大量研究表明草地的退化降低了土壤中酶的活性。土壤中過氧化氫酶的活性隨退化程度的加劇變化不明顯，而其他3個酶的活性具有顯著地變化，說明過氧化氫酶對高寒草甸的退化不敏感。

3.2 高寒草甸退化對土壤微生物生物量的影響

土壤微生物量作為反映土壤良好狀態的關鍵性指標，能夠快速表征微生物的活躍性[30]。因此，通過對微生物生物量的研究能夠幫助人們進一步探究植物-土壤-土壤微生物之間的互作關系。土壤微生物生物量受到多種生態因素影響，其中，包括植被類型[31]，土壤質地等[11]。隨高寒草甸退化程度的加劇，土壤中MBC，MBN和MBP的含量呈現逐漸降低的趨勢，與Zhao等[10]報道的結果相似。這些發現表明，植物群落的改變以及植被蓋度的降低能夠減少土壤中MBC，MBN和MBP的含量。從另一方面分析，由于高寒草甸在太陽直射下，導致土壤的水土保持能力和養分的流失加速，因此，當草甸區樣地退化嚴重時，植被蓋度和高度的下降，從而使微生物的生長和發育受到抑制。從微生物生物量的角度分析，未退化樣地的植物蓋度和高度顯著強于重度退化草地，因此，ND中土壤中微生物生物量顯著高于SD，與研究結果一致，植物的多樣性能夠反映土壤中微生物的生物量。同時研究發現，根際土壤中MBC，MBN和MNP含量顯著高于非根際土壤中，這就進一步說明，植物根系分泌物的減少和植物凋落物數量的降低，使土壤中養分的基底物質含量降低，從而制約土壤微生物生物量的生長和繁衍，這與張超等[32]的研究結果具有相似性。因此，而土壤微生物對于草地農業生態系統的動態響應非常劇烈。

3.3 高寒草甸退化對土壤微生物數量與組成的影響

在高寒草甸生態系統中，土壤微生物的群落結構對外界環境和土壤狀況有較強的依附性，微生物的群落結構對外界資源的變化具有耐受性和靈敏性[33]，因此，微生物群落結構能夠準確并迅速反應土壤微域的變化狀況。研究發現，高寒草甸隨退化程度的加劇，土壤中真菌、細菌、放線菌的數量呈逐漸降低的趨勢，這與試驗中植物群落多樣性的改變，土壤養分狀況，土壤酶的活性以及土壤微生物生物量的變化具有一致性，這說明，微生物的群落結構與環境因子均有關系，都是外部環境的變化使整個土壤微環境發生改變。由于草地生態系統發生了逆向演替的現象，使草地的覆蓋度降低，從而使太陽光直射土壤層，抑制了一部分微生物的生長，并伴隨大量微生物的死亡，這與薛亞芳等[34]研究的結果具有相似性。同時對比微生物群落結構中真菌、細菌、放線菌的數量可知，在高寒草甸土壤中細菌>放線菌>真菌，這與該地區土壤pH有相關性，真菌能夠適應偏酸環境，而細菌和放線菌適應偏堿環境。因此，土壤中真菌的數量顯著低于細菌和放線菌的數量，這與王國榮等[35]的研究一致。研究還發現，不同退化樣地微生物的群落結構表現為根際土壤顯著高于非根際土壤，其原因是，不同優勢物種根際過程以及土壤酶活性對微生物群落起到一定的調控作用。因此，高寒草甸的退化對于土壤中微生物數量與組成有深遠的影響。

4 結論

(1)高寒草甸區域發生退化時，將會導致退化區域植物的種類、數量、高度以及蓋度不斷降低；根際和非根際土壤養分不斷降低，同時根際和非根際土壤中過氧化氫酶、脲酶以及蛋白酶的活性等相關酶的活性不斷下降；根際和非根際土壤中微生物生物量碳、氮和磷的含量不斷下降，并且根際和非根際土壤中真菌、細菌以及放線菌的數量表現為逐漸降低的趨勢；(2)同一退化程度中，根際土壤中SOC、TN、TP以及AP的含量均顯著高于非根際土壤，同時根際土壤中pH低于非根際土壤；根際土壤中土壤過氧化氫酶、土壤脲酶、土壤蛋白酶以及土壤蔗糖酶的活性均顯著高于非根際土壤；根際土壤中MBC，MBN和MBP的含量顯著高于非根際土壤；土壤3大類微生物數量，根際土壤顯著高于非根際土壤；(3)不同退化程度高寒草甸根際土壤和非根際土壤中3大類土壤微生物數量總體表現為細菌>放線菌>真菌；(4)草地退化過程中，優勢物種的改變對草地微生物群落具有重要的影響，同時，根際過程對草地植物的生長和發育尤為重要。