馬西利亞菌B260的分離鑒定及促進育苗的效果

郭宇澤 丁雪敏 姚嵐 許德敏 趙雨潔 馮福應 孟建宇

（內蒙古農業大學生命科學學院應用與環境微生物實驗室，呼和浩特 010018）

合理育苗可使所培育幼苗苗壯、根系發達、移栽不緩苗和生長快等而在農業生產中應用廣泛。基質是決定育苗成功與否的關鍵因素。傳統的育苗基質只起提供營養、保水和固定支撐等作用［1]。目前，我國育苗基質質量和水平還有待提高，而添加植物生長促生微生物可能是有效措施和途徑之一［2]。但相關研究和實踐較少。僅有的少量研究表明，添加植物根際促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）—芽孢桿菌（如解淀粉芽孢桿菌 SQR9）等可顯著提高番茄等的育苗效果［2-4]。PGPR 所包括的細菌類群很多［5]，但除芽孢桿菌外其它類群的細菌尚未見用于植物育苗的研究報道。

馬西利亞屬（Massilia）是在 1998 年提出的一個新菌屬，其模式菌株Massilia timonae為分離自人體血液的Massilia timonaeCIP 105350T［6]。而近年來，從許多植物根際也發現了馬西利亞屬菌種，并且一些菌株在體外表現出與促進植物生長有關的特性，包括IAA的產生［7]、鐵孢子的產生［8]和體外對疫霉菌［9]的拮抗作用。但目前對馬西利亞菌在植物促生效果方面的研究還相對較少。本研究分離純化得到的一株馬西利亞屬的菌株 B260，具有多種植物促生性狀，且固氮、解磷能力較強，可促進番茄、黃瓜、甘草和黃芪幼苗生長，旨為該菌用于育苗提供理論依據和奠定實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 根際土的采集、供試菌種及種子 參考席嬌［10]取樣方法，采集巴拉貢地區沙冬青的根際土。菌株 B260 是分離自巴拉貢沙冬青根際的一株植物促生菌。

本研究所用番茄種子為西安市群星種業有限責任公司的上海908，黃瓜種子為山東省德州魯德種業有限公司的津春四號以及購置于民勤縣花果山農林工程有限公司的黃芪和甘草。

1.1.2 主要試劑和儀器及培養基 DL2000 DNA Marker、SYBR GreenⅠ熒光染料（北京全式金生物技術有限公司），常規化學試劑均為國產分析純（國藥集團化學試劑有限公司），全自動高溫高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogyo Co. Ltd.），生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司），MGC-350BP-2型光照培養箱（上海今有實驗設備有限公司），GQ-75RZ 型高速管式離心機（遼陽鑫陽光液體分離設備有限公司），Synergy-H4型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

無機磷培養基、有機磷（植酸磷）培養基及Ashby 培養基［11]，DF 培養基及 ADF 培養基、R2A培養基、LB 培養基［12]。

改良 PVK 培養基（g/L）：葡萄糖10.0，磷酸鈣 5.0，硫酸銨0.5，氯化鈉0.2，七水合硫酸鎂0.1，氯化鉀0.2，酵母粉0.5，一水合硫酸錳0.002，七水合硫酸亞鐵 0.002，0.4% 溴酚藍（pH 6.7）6.0，pH 7.0-7.2。

1.1.3 育苗基質 育苗基質的基本組分含秸稈、黏土、磷鉀礦粉、營養土，其重量比為30∶12∶1∶15，其中磷鉀礦粉為磷礦粉和鉀礦粉等重量比混合物。

1.2 方法

1.2.1 根際促生細菌的分離純化及培養 稱取1 g根際土壤放入裝有99 mL無菌水的三角瓶中，28℃，180 r/min，振蕩30 min，靜置15 min。吸取上述懸液1 mL，用無菌水稀釋，制備10-1-10-5五個梯度稀釋液，將稀釋液接種涂布于固氮和無機磷固體培養基，劃線至無雜菌，選擇能力較強的B260用于后續研究。B260液體培養用1/2 R2A，于溫度 37℃和轉速 150 r/min 下振蕩培養36 h。

1.2.2 1 6S rRNA基因擴增與系統進化分析 將菌株活化后提取細菌總DNA為模板，27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）為引物，擴增體系和條件參考楊鴻儒［13]擴增16S rRNA基因。PCR 產物送生工生物工程（上海）股份有限公司純化及測序。在 Ez-Taxon（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）數據庫中與模式菌株進行同源性比對，確定其種屬；之后基于 Neighbor-Joining 法，利用MEGA 7.0 軟件中相關模塊、以默認參數構建系統發育樹。B260 的 16S rRNA 基因登錄號為 MN173846。

1.2.3 PGPR菌株的基本促生能力分析 參考楊鴻儒等［13]對菌株固氮能力、解植酸磷（有機磷）能力、解無機磷能力及產鐵載體能力進行分析；參考Glickmann 等［14]對菌株產 IAA 能力進行分析；參考Penrose 等［15]對菌株 ACC 脫氨酶活性進行分析。

1.2.4 育苗及實驗設置 將已滅菌的育苗基質裝至距離市售聚苯乙烯育苗盤（規格：穴數50，高 4.5 cm，上邊長18 cm，下邊長 8 cm）穴檐1 cm處；挑選完整飽滿種子進行春化誘導后播種，之后覆蓋基質約1 cm；設2個處理，即添加菌株B260的pB260以及不添加菌的CK，每組處理5個生物學重復；以10 000×g離心力離心 B260 培養液，對離心所得沉淀物以蒸餾水重懸、再離心進行洗滌，反復3次，最后再以蒸餾水重懸，菌液濃度106CFU/mL；pB260處理中的育苗穴在播種后每穴澆30 mL重懸菌液，對照CK澆等體積的蒸餾水；將育苗盤置于光照培養架上培養至30 d，期間適當澆灌蒸餾水，使基質處于濕潤狀態。

1.2.5 幼苗生長性狀測定

1.2.5.1 發芽率、株高、根長的測定 植物在育苗盤出苗生長至 30 d，記錄發芽數，計算發芽率。將植株挖出，并將所有幼苗洗凈擦干后，平鋪于水平臺上，用刻度尺量出幼苗的長度，再用鑷子將植株根系拉直，測定主根長度，并做記錄。

1.2.5.2 生物量的測定 將植株表面泥土去除、洗凈、用濾紙將水吸干，測其鮮重生物量；再用信封將其包裝，置于烘箱，在80℃下烘48 h至恒重，用電子天平測其干重生物量，并做記錄。

1.2.5.3 葉綠素含量的測定 選取植物頂葉至倒四葉，去除葉脈，混勻后剪碎，稱取 0.2 g 放入 25 mL 具塞比色管中，25℃避光培養，且多次搖動，待葉片全部變白即可測定，以提取液為空白對照，用分光光度計測定 OD663和 OD645，重復3次。計算公式為：葉綠素含量（mg/g）=（20.29×OD645+8.05×OD663）×5/40。

1.2.6 數據處理 利用 Microsoft Excel 2013 進行數據處理及圖表繪制，采用單因素方差分析［16]（One-Way ANOVA）和新復極差法進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果

2.1 16S rRNA基因序列的系統發育進化樹構建

測序所得 B260 的 16S rRNA 的基因序列長度為 1 222 bp，經 Ez-Taxon 分析表明，該序列與現有模式菌株Massilia plicata76T的相似性最高，為99.85%。系統發育分析結果（圖1）也表明，B260與M. plicata76T菌株親緣關系最近，且其在進化樹上與Massilia屬模式種處于同一進化支，說明該菌株屬于Massilia屬。

2.2 植物促生性狀和能力分析

菌株 B260 的適宜生長溫度為 32℃、適宜生長pH 6.0，適宜生長鹽度為 3%。其還具有固氮、解磷（無機磷-解磷酸鈣和有機磷-植酸磷）、產IAA、產ACC脫氨酶和產鐵載體的植物促生性狀，且固氮和解解無機磷能力較強，而其它能力相對較弱（表1）。

表1 植物促生性狀和能力

2.3 幼苗生長性狀分析

2.3.1 幼苗的生長形態 直接觀察從育苗盤穴挖出的幼苗形態發現，添加菌株B260的處理pB260相比不添加的處理CK的幼苗更大、更壯，特別是明顯促進了番茄和黃瓜幼苗根系的發育。而更發達的根系將育苗基質纏繞得更加緊實、這有利于移苗過程中苗塊形態和水分的保持，生長促進效果最為突出（圖2和圖3）。

圖2 B260處理下黃瓜的育苗形態

2.3.2 幼苗的生長性狀 育苗30 d 后，pB260 較 CK處理下的番茄、黃瓜、甘草及黃芪的生長性狀均有不同程度的提高。其中，發芽率提高最大的為黃芪（37.08%）、其次為甘草（27.27%）；株高提高最大為黃瓜（34.39%）、其次為甘草（17.04%）；根長增長最大的為黃瓜（90.47%）；葉綠素含量提高最大為甘草（22.73%）、其次為黃芪（14.29%）；整株干重提高最大為甘草（133.33%）、其次為番茄（75.00%）；整株鮮重提高最大也為甘草（35.71%）、其次為番茄（18.75%）（表 2）。

而且 B260 對番茄和黃瓜的根系形態影響顯著，圖3-A、3-B 可見接種菌株的番茄和黃瓜根系發達，主根更長，而對照主根較短，表明這株菌對番茄和黃瓜根系的生長發育具有明顯促進作用，可以作為番茄和黃瓜專用微生物肥料的首選菌種。

圖3 四種植物幼苗生長性狀

3 討論

培育健壯幼苗對實現作物早熟增產有重要作用［17]。近年來，育苗逐漸成為現代農業生產中一種使植物快速、穩定生長發育的技術。育苗基質支持著穴盤苗從種子萌發到幼苗移栽的生長過程，基質的優劣是育苗成敗的基礎和關鍵［18]。目前的育苗中，大多是使用草炭作為基質的主要成分，其育苗效果較好，但其來源匱乏且不可再生。因此，選取更好的、取材更易的基質來減少草炭使用成為未來育苗的必經之路。任志雨等［19]研究說明，在育苗基質中加入蛭石或草炭可明顯改善基質的理化性狀。50%秸稈加50%蛭石或草炭處理的黃瓜幼苗的株高、鮮重和葉綠素含量均大于其它處理。而本研究中則以農業廢棄物秸稈作為主要成份，以少量營養土和磷鉀礦粉復配，有較好保水效果、成本低和容易操作等優點［20]。少量研究表明，基質中添加PGPR可促進育苗。PGPR 是一種有益的、自由生活的土生細菌［21-22]，PGPR 通過生物固氮、植物激素的合成、養分的吸收以及提升寄主植物對生物、非生物脅迫的抗性來促進植物生長［23-24]。在育苗過程中加入植物促生微生物，可明顯增加幼苗的成活率，降低土傳病的危害。浩折霞［25]研究發現，將具有多種植物促生性狀的優化功能菌組合 HR69+QL-A6 接入基質中，明顯提高了番茄幼苗出苗率、植株地上部與地下部干重、根系活力，分別增加 9%、47.9%、27.3%、28.7%，莖粗增加 28%，使番茄幼苗具有更強的抗倒伏性和環境適應性。朱忠彬等［26]研究發現，短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3 能顯著促進煙草的生長。岳東霞［27]研究發現，假單胞菌CBT1、CBT6 及 CBT7 對黃瓜枯萎病具有一定的防治效果。王娟等［28]表明，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）HG28-5 浸種處理能顯著提高黃瓜的出苗勢，提高出苗整齊度；顯著增加苗期黃瓜株高、根長、鮮重。梁建根等［29]研究表明，CH1 短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）與 CH2 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）都顯著地提高了葉綠素的含量，從而間接地促進了黃瓜的生長。但是對于Massilia在植物促生方面的研究鮮見報道。本研究中菌株 B260屬于馬西利亞菌，其具有多種植物促生性狀，其具有的較強固氮和解磷能力可能為植物生長提供較充足的氮和磷營養供應。根長和根系干重的增加還可能與菌株合成 IAA 能力有關，有利于增加根表面積，有效促進根系的新陳代謝［30]。B260 具有的產 IAA等激素等性狀，也明顯促進了所研究植物根形態的建成。特別是甘草和黃芪作為藥材，藥用部分最主要為根。因此，根系的生長發育對育苗甚為重要［31-32]，較好的根系形態有助于移苗成活和后期的生長發育。而存留于育苗基質“微環境”中的所添加的 PGPR在移苗后還可能繼續發揮植物促生功能和作用。總之，在育苗基質中添加諸如馬西利亞菌或芽孢桿菌等 PGPR 從而促進育苗是可行的。

表2 菌株B260對4種植物的苗期生長性狀

4 結論

Massiliasp. B260 具有多種植物促生能力，在育苗方面表現出良好的促生效果，這為未來開發、研究作為育苗基質用菌種提供了理論依據，并奠定了實踐基礎。