HPLC-MS/MS法測定安神類代用茶中19種鎮靜安神類非法添加物質

劉國姣，王彬，曾妮，江豐，*，吳婉琴，王會霞，郭曉希，張苗

（1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院，湖北武漢430075；2.湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心，湖北武漢430075）

隨著生活節奏的加快，越來越多的人面臨著失眠的困擾[1-2]。最新調查顯示，中國成年人失眠率為38.2%，長期失眠會引發焦慮、抑郁、緊張等情緒，同時有引發糖尿病、高血壓等疾病的風險，長期失眠的人死亡率更高[3-5]。為了緩解失眠癥狀，一些失眠嚴重的患者常借助于鎮靜安神類藥物來助眠，但考慮到長期服用這類藥物會帶來較大的副作用損害身體健康，現在更多的人傾向于通過食用一些標示有助眠安神功效的天然食品來減輕癥狀，例如安神類代用茶、保健食品等，然而不少廠商為了增強產品功效，牟取暴利，擅自在鎮靜安神類食品中非法添加化學物質，對消費者健康造成極大威脅。常見的安神類非法添加化學物質主要有苯二氮卓類（地西泮、氯氮卓、奧沙西泮、三唑侖、硝西泮、阿普唑侖、艾司唑侖、勞拉西泮、氯硝西泮、咪噠唑侖等）、酚噻嗪類、抗組胺類（馬來酸氯苯那敏等）、巴比妥類（苯巴比妥、司可巴比妥、巴比妥、異戊巴比妥）等，這些物質大部分都是國家嚴格監管的藥物，若使用不當或濫用將造成嚴重不良后果，且禁止添加在任何食品中。因此，建立一種快速、簡單、高效的分析方法對安神類食品的質量安全與相關風險監測工作具有重要的現實意義。

目前普通食品中沒有針對鎮靜安神類化合物的檢測標準，只是在鎮靜安神類中成藥及改善睡眠類保健食品中，國家食品藥品監督管理局相繼出臺了對應的補充檢驗方法和檢驗項目的批準件，批準件編號分別為2009024、2012004 和2013002，檢測項目分別為15 種（分別為地西泮、硝西泮、氯硝西泮、氯氮卓、奧沙西泮、馬來酸咪噠唑侖、勞拉西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥、氯美扎酮）、4 種（分別為褪黑素、氯苯那敏、佐匹克隆、扎來普隆）和3 種（分別為羅通定、青藤堿、文拉法辛），檢測方法均包括薄層色譜法、高效色譜法及高效液相色譜-質譜聯用方法，但不同的批準件里涉及的提取溶劑、提取方法、液相、液質條件各不相同，部分提取方法操作復雜，缺乏系統性且無檢出限，給日常食品監管帶來不便。文獻報道的測定鎮靜安神類非法添加物質的常見檢測方法有薄層色譜法[6-8]、液相色譜法[9-12]、液相色譜-串聯質譜法[13-20]、氣相色譜-串聯質譜法[21-24]等。其中，液相色譜-串聯質譜法具有定性能力強、選擇性好、靈敏度高等優點，近年來，在非法添加物測定中得到了廣泛應用，但有關安神類代用茶中安神類非法添加物測定的文獻報道少見。本試驗以19 種非法添加物質（褪黑素、氯美扎酮、馬來酸氯苯那敏、鹽酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑侖、氯氮卓、扎來普隆、氯硝西泮、勞拉西泮、咪噠唑侖、氯氮平、三唑侖、羅通定、阿普唑侖、青藤堿、佐匹克隆、奧沙西泮、地西泮）為研究對象，建立一種同時測定安神類代用茶中19 種非法添加物的液相色譜-串聯質譜法，本方法快速、靈敏，能滿足高通量測定食品中多種非法添加物的含量，為政府部門加強食品質量監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安神茶樣品：市售，粉碎均質后待檢測。

褪黑素標準品（純度99.0%）、馬來酸氯苯那敏標準品（純度99.0%）、鹽酸文拉法辛標準品（純度99.0%）、氯硝西泮標準品（純度99.0%）、勞拉西泮標準品（純度99.0%）、咪噠唑侖標準品（純度99.0%）、三唑侖標準品（純度99.0 %）、羅通定標準品（純度99.0 %）：Dr.Ehrenstorfer 公司；氯美扎酮標準品（純度99.9%）、硝西泮標準品（純度99.8%）、艾司唑侖標準品（純度99.9%）、氯氮卓標準品（純度99.8%）、氯氮平標準品（純度98.7%）、阿普唑侖標準品（純度98%）、青藤堿標準品（純度98.0%）、奧沙西泮標準品（純度99.9%）、地西泮標準品（純度99.8%）：A ChemTek.Inc 公司；佐匹克隆標準品（純度98%）、扎來普隆標準品（純度98%）：Toronto Research Chemical 公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；水（色譜純）：Millipore 公司。

1.2 儀器與設備

API 4500 型三重四極桿串聯質譜儀：美國AB SCIEX 公司；UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國戴安公司；ME2002E/02 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Allegra X-15R 型低速冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；Elmasonic S180H 超聲儀：Elma Hans Schmidbaner GmbH&Co.KG 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

標準儲備溶液的配制：準確稱取適量的褪黑素、氯美扎酮、馬來酸氯苯那敏、鹽酸文拉法辛、硝西泮、艾司唑侖、氯氮卓、扎來普隆、氯硝西泮、勞拉西泮、咪噠唑侖、氯氮平、三唑侖、羅通定、阿普唑侖、青藤堿、佐匹克隆、奧沙西泮、地西泮標準品，用甲醇溶解并定容，分別配制成0.1 mg/mL 的單一標準儲備溶液，密封，于4 ℃保存。

混合標準品溶液的配制：取上述標準品儲備溶液適量，根據各物質的響應信號強度的不同用甲醇釋至相應的濃度范圍的混合標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

精確稱取樣品約1 g（精確到0.001 g）于50 mL 的具塞離心管中，加入25 mL 乙腈，于25 ℃超聲提取20 min，在 4 000 r/min 離心分離 5 min，取上清液 10 mL，用水稀釋至20 mL，用0.22 μm 濾膜過濾，供高效液相色譜-質譜儀檢測用。

1.3.3 液相色譜-質譜分析條件

色譜條件：采用ACE Excel 2 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流速 0.3 mL/min，流動相：A 為 0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇。柱溫30 ℃，進樣體積5 μL，梯度洗脫條件見表1。

質譜條件：正離子模式掃描；離子源：電噴霧離子源（ESI 源）；檢測方式：多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣（CUR）：35 psi（1 psi=0.006 89 MPa）；霧化器（GS1）：55 psi；輔助氣（GS2）：55 psi；離子源溫度（TEM）：500 ℃。優化后的質譜參數見表2。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

表2 19 種非法添加物質的質譜參數Table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

續表2 19 種非法添加物質的質譜參數Continue table 2 Monitored ions，declustering potential and collision energy of 19 kinds of illegal additives

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

參照國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2009024、2012004、2013002中流動相的條件。本方法比較了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）分別作為流動相時，對19 種待測化合物的色譜分離和質譜靈敏度的影響。結果顯示，選擇甲醇-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸)和乙腈-5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸)作為流動相時各分析物的響應比甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時響應低，且甲醇-0.1%甲酸水比乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時各物質間的分離效果更好，且青藤堿的峰形得到改善，因此，本方法選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相。

2.2 提取溶劑的選擇

根據19 種目標分析物的結構特性和化學性質，本試驗考察了甲醇、乙腈、酸化甲醇（含0.1%甲酸），酸化乙腈（含0.1%甲酸）分別作為提取溶劑時對19 目標分析物提取效果的影響，結果見圖1。

如圖1 所示，19 種目標分析物均在乙腈作為提取溶劑時具有更好的提取效果，其中在甲醇和乙腈中加入0.1%甲酸對各目標物的回收率無明顯影響，因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對回收率的影響Fig.1 Effect of extracted solvents on recovery rate

2.3 方法線性范圍及檢出限

根據各目標分析物響應強度的不同，分別吸取一定體積的各目標分析物的標準溶液，用空白樣品的基質溶液稀釋，配制成一系列不同質量濃度的標準溶液。以目標物色譜峰的峰面積為縱坐標，化合物的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結果見表3。

結果表明褪黑素、氯美扎酮、青藤堿、奧沙西泮、勞拉西泮、氯氮卓在質量濃度為1 ng/mL～100 ng/mL；馬來酸氯苯那敏、羅通定、硝西泮、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、氯硝西泮、扎來普隆、三唑侖、鹽酸文拉法辛在質量濃度為0.5 ng/mL～50 ng/mL；氯氮平、咪噠唑侖在質量濃度為0.2 ng/mL～20 ng/mL；佐匹克隆在質量濃度為5 ng/mL～500 ng/mL 范圍內線性良好。根據以3 倍基線噪聲所對應的濃度作為測定方法的檢出限，10 倍基線噪聲所對應的濃度作為測定方法的定量限，得出各目標分析物的檢出限和定量限，滿足19 種非法添加物質高靈敏度檢測的需要。

表3 19 種非法添加物質的線性范圍、回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limit and quantification limit of 19 kinds of illegal additives

2.4 回收率及精密度試驗

為了考察本方法的可行性，在本試驗條件下，向安神類代用茶空白基質中添加低、中、高3 個水平濃度的19 種安神類非法化學添加物質混合標準溶液，每組添加6 個平行，回收率及精密度結果見表4。

表4 加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

續表4 加標回收率和相對標準偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

續表4 加標回收率和相對標準偏差（n=6）Continue table 4 Recoveries and relative standard deviation of spiked samples

由表4 可知，6 次試驗結果的回收率均在80.5%～108.8%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于 10%。

2.5 安神茶樣品測定

對采購的20 批次標注有安神助眠功能的代用茶按照本研究方法進行前處理和分析檢測，結果表明，20批次的安神茶中均未檢測出19 種非法添加物。

3 結論

本研究基于高效液相色譜-串聯質譜技術建立了快速測定安神類代用茶中褪黑素等19 種非法添加物的檢測方法，19 種分析物在其相應的濃度范圍內峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，相關系數（R2）均大于 0.99，該方法的檢出限為 10 μg/kg～200 μg/kg，定量限為 30 μg/kg～600 μg/kg，樣品的回收率為 80.5 %～108.8%。本方法簡單易行，靈敏度高，是一種高效且低成本的檢測方法，方法的準確度、精密度及靈敏度均滿足日常檢測要求，可適用于實驗室大批量的代用茶樣品檢測，為食藥監部門提供強有力的技術支持，保障人民群眾的食品安全。