杉木苗組織培養(yǎng)外植體的選擇及其消毒方法①

饒寶蓉

(福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建建陽354200)

杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.］又名沙木、沙樹等，屬松柏目杉科喬木，高30 m，胸徑可達(dá)2.5～3 m，是我國特有的常綠針葉樹種之一。杉木栽培歷史悠久，地域分布十分廣闊，是我國南方山區(qū)重要的造林樹種之一［1］。杉木紋理順直、耐腐防蟲，廣泛用于建筑、橋梁、電線桿、造船、家具和工藝制品等方面。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國建材約有1/4是杉木。杉樹生長快，一般只要10 a就可成材，是我國南方最重要的特產(chǎn)用材樹種之一。

杉木種子育苗子代存在長勢參差不齊，出現(xiàn)變異株等不良性狀，而組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖苗木的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠在短期內(nèi)大量繁殖遺傳基因型比較一致的優(yōu)良材料，充分利用繁殖材料的遺傳潛能，發(fā)揮最佳的效益［2-3］。從20世紀(jì)80年代就對杉木苗開展了無性系選育、扦插試驗(yàn)，探索了杉木扦插生根的遺傳變異規(guī)律［4-6］。闕國寧［7-8］于1980年開始進(jìn)行杉木組培技術(shù)試驗(yàn)研究，探索了不同年齡母本上外植體的嫩梢增殖規(guī)律和成年母本外植體的組培復(fù)壯技術(shù)。但是，在杉木苗外植體選取，如何處理，以期更好地建立無菌體系研究方面較少。目前，木本科植物如紅豆杉、梧桐、紅楓等的組培快繁仍存在組培材料消毒困難、易褐化、增殖率低及生根困難等問題。無菌體系的建立是植物組培成功的關(guān)鍵。其中，外植體種類、取材部位和消毒方法是影響無菌體系建立的重要因素。自然條件下，植物外植體帶有較多的細(xì)菌和真菌，進(jìn)行組培時需對其進(jìn)行消毒滅菌，但要求不損傷其組織材料，保持生活力，使其在良好的培養(yǎng)條件下很快恢復(fù)生機(jī)，正常生長和繁殖［9-10］。較適的消毒方式能夠殺滅細(xì)菌，降低外植體的傷害，有助于其快速適應(yīng)生長環(huán)境。通過調(diào)整消毒時間或消毒劑種類［11-13］，以及消毒后去除外層老化組織［14］等方法均能達(dá)到提高無菌率的效果。杉木苗與其他作物相比生長緩慢，新發(fā)嫩枝多發(fā)于春秋兩季、針葉多，莖表皮不光滑，感染率高且消毒后易褐化死亡，對其組培影響較大。為此，筆者于2015年以20 a苗齡杉木及種苗圃內(nèi)1 a苗齡杉木的莖尖、莖段為外植體試材，對滅菌時間、外植體類型和取材時間等進(jìn)行研究，以期篩選出杉木苗培養(yǎng)適宜的外植體類型，取材時間及其消毒方法，為杉木苗的無性繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以福建省建陽區(qū)國有林場杉木試驗(yàn)林中選出20 a苗齡，樹干筆直，生長快、生物總量高、優(yōu)質(zhì)、耐瘠薄等優(yōu)質(zhì)的杉木的春秋新稍，和種苗圃內(nèi)同棵數(shù)剪下枝條扦插成活的1 a苗齡的新稍作為組培試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理與接種后培養(yǎng)

將采回的外植體修剪成5 cm左右，剪去過長的針葉，除去表皮上的灰塵和雜物等，用洗潔精清洗并浸泡15 min，再用流水沖洗30 min，后用蒸餾水沖洗2次，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，備用。處理好的外植體均接到MS+6-BA 0.8 mg/L+KT 0.5 mg/L的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每瓶接一個外植體，外植體大小1 cm左右，轉(zhuǎn)接好后放入溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時間12 h/d條件下培養(yǎng)。

1.2.2 不同消毒時間對外植體消毒效果的影響

將外植體按1.2.1方法預(yù)處理后，先用75%酒精浸泡15～30 s，后將外植體用0.1%升汞消毒，分為4個處理，4處理的消毒時間分別為6、8、10和12 min，每處理均加入1～2滴吐溫80，振蕩后再用無菌水沖洗4～6次，每個處理接種90個，3次重復(fù)。20 d后觀察，統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 不同外植體消毒效果比較

在春季將取回來的外植體按1.2.1方法進(jìn)行預(yù)處理，后用1.2.2篩選出的方法進(jìn)行消毒，將外植體分為3種類型，莖尖，莖段，去針葉莖段。每個處理接種90個，3次重復(fù)。20 d后觀察，統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 不同取材時間對外植體消毒的影響

在春季4月和秋季9月連續(xù)取材，分別取苗齡1 a和20 a的植株嫩莖段。其中，外植體均去除莖尖后緊接的一段，接種時去除針葉。進(jìn)行取材季節(jié)對外植體萌芽率的影響的比較。每個處理接種30個外植體，3次重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各處理培養(yǎng)30 d后分別統(tǒng)計(jì)萌芽率、感染率、死亡率，采用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù)，并采用JMP10.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對莖段消毒效果的影響

莖段消毒后用無菌紙吸干水分，斜插于培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2 d后進(jìn)行光照，以減少其褐化。培養(yǎng)到第5天時，莖段開始出現(xiàn)感染，且感染主要發(fā)生在消毒時間為6、8 min的處理。在培養(yǎng)1～18 d時出現(xiàn)較多感染，18 d后感染減少；在培養(yǎng)第25天時沒有感染再發(fā)生，其中感染主要表現(xiàn)為霉菌感染。從表1可見，不同的升汞消毒時間，莖段的感染率、死亡率和萌芽率也隨之發(fā)生相應(yīng)變化。消毒6～12 min，隨著消毒時間的延長，其感染率逐漸下降，死亡率則呈上升的趨勢。其中，消毒6 min莖段感染率最高，達(dá)83.33%，顯著高于8、10、12 min的，而萌芽率最低，只有6.66%；消毒10、12 min時的萌芽率分別為51.11%、43.33%，二者未達(dá)到顯著差異。綜合感染率、死亡率和萌芽率3個指標(biāo)可見，莖段的最佳消毒時間為升汞消毒10 min。

表1 消毒劑處理時間的不同對莖段消毒效果的影響

2.2 不同外植體的消毒效果

表2可知：（1）從萌芽率上看，去針葉莖段的萌芽率最高，為40.00%，其次是莖段，萌芽率為28.33%，莖尖的萌芽率最低，為8.33%；去針葉莖段與莖段的萌芽率差異不顯著，但是兩者與莖尖的差異達(dá)顯著。（2）從感染率上發(fā)現(xiàn)莖尖的感染率最高，為80.83%。莖段感染率為50.00%，去針葉莖段感染率最低，僅為37.50%；莖尖的感染率顯著高于莖段和去針葉莖段，后二者差異未達(dá)到顯著。（3）死亡率方面，莖尖、莖段、去針葉莖段三者的死亡率分別為10.33%、21.66%、22.50%，三者均未達(dá)顯著差異。綜合3個指標(biāo)可見，莖尖消毒困難，杉木的外植體以去針葉莖段為好。

表2 杉木不同類型外植體的消毒效果 單位：%

表3 不同取材時間杉木外植體的消毒效果 單位：%

2.3 不同采集時間對外植體消毒效果的影響

從表3可知，由于外植體采集時間，以及外植體的苗齡的不同，其體內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)及其木質(zhì)化程度也有差別，致使外植體的消毒難易程度不同。其中，苗齡小（1 a）的木質(zhì)化程度比較低，春季、秋季采集萌芽率分別為73.33%、51.11%，均顯著高于苗齡大的（20 a），萌芽率為45.56%、12.78%。因此，相同季節(jié)采集的外植體，苗齡小的萌芽率優(yōu)于苗齡大的。苗齡小的感染率顯著低于苗齡大的。這與苗齡小枝條木質(zhì)化程度低，帶菌量少，較易消毒有關(guān)；同時，由于苗齡小處于生長期，其體內(nèi)的酚類物質(zhì)含量相對較高，使得外植體消毒后易出現(xiàn)褐化死亡，又因其較為幼嫩，消毒劑對其組織傷害也較大。因此，苗齡低感染率較低，但是褐化死亡率較高，分別為12.22%和14.44%。從表3還可以看出，在同苗齡的前提下，春季采集的莖段，其消毒效果優(yōu)于秋季，如20 a苗齡的苗木，春季采集萌芽率45.56%，而秋季只有12.78%，達(dá)到顯著性差異。苗齡1 a的苗木，春季采集萌芽率為73.33%，與秋季的萌芽率53.11%達(dá)顯著性差異。綜合以上因素，在春季取材，選擇1 a苗齡的杉木有利于無菌體系建立。

3 討論與結(jié)論

研究結(jié)果表明，杉木的外植體選擇以莖段為好，且以消毒后去針葉的莖段進(jìn)行組培效果最好，啟動率高，芽長勢好（圖1）；春稍比秋稍更有利于無菌體系建立，因此采集時間上比較，春季優(yōu)于秋季。年限上，苗齡小比苗齡大的更有利于無菌系建立。苗齡小木質(zhì)化低，更有利于細(xì)胞的增殖與分化，這與黃發(fā)新等［15］對不同生理老化程度的杉木組培效果中總結(jié)出杉木成年樹上部枝條組培時其芽分化數(shù)、嫩梢數(shù)和長度、生根率均極顯著地低于樹干根頸萌條，在機(jī)理上有一定的相似性。此外，杉木苗外植體在消毒過程中，消毒時間適當(dāng)延長可以降低感染，但是會傷害到組織導(dǎo)致外植體死亡率升高，萌芽率下降。消毒時間與外植體木質(zhì)化程度、暴露于空氣中的時間、雜菌等附作物有關(guān)，因此，外植體消毒時，要掌握好各個指標(biāo)的平衡關(guān)系，盡量減少因消毒產(chǎn)生的對外植體的傷害，以免使外植體消毒后在培養(yǎng)過程中啟動慢，或者不啟動［16］。杉木苗組培過程中出現(xiàn)的褐化問題與唐軍榮等［17］在紅花山玉蘭組織培養(yǎng)外植體的選擇及其消毒方法一文中對紅花山玉蘭的研究有相似之處，都存在外植體極易產(chǎn)生褐化，在其切口處會分泌較多的酚類物質(zhì)逐漸滲入到培養(yǎng)基，導(dǎo)致外植體死亡。該試驗(yàn)通過添加活性炭和抗壞血酸及結(jié)合縮短轉(zhuǎn)接時間對降低外植體的褐化率起到了一定的效果。

圖1 杉木莖段外植體組培效果