基于席夫堿類香蕉枯萎病殺菌劑的合成及抑菌效果①

毛海清 袁夢婷 張鵬道 龍籍由 唐子茜 袁曉玉 于春偉

(海南醫學院熱帶醫學與檢驗醫學院 海南海口571199)

香蕉枯萎病是世界香蕉產區的重要病害，在我國廣東、廣西、福建、海南、臺灣等部分香蕉種植區嚴重發生［1］。研究表明，香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌侵染香蕉根部所引起的一種土傳性維管束病害［2-3］。目前，香蕉枯萎病主要防控措施有選育抗病品種［4］、化學藥劑［5-6］、作物輪作［7-8］、生物防治［9-10］、分子遺傳改良［11-12］等。基于抗病品種產量普遍不佳［13］，而大多拮抗菌抑制作用不強，普及推廣范圍較小［3］。化學防治盡管對環境有一定的污染，但作為一種簡單、快速、低成本的防治方式，在香蕉的生產實踐中仍具有重要的指導意義。

席夫堿是一類含甲亞胺基或亞胺基的有機化合物，能通過配位共價鍵和很多金屬離子形成配合物，在抑菌、抗腫瘤、抗病毒等方面表現出驚人的藥理活性。江峰等［14］研究表明，殼聚糖香草醛席夫堿對獼猴桃果汁中分離到4株污染菌分別為枝孢菌、歧皺青霉菌、雜色曲霉菌、堅強芽胞桿菌具有明顯的抑制效果。江璽等［15］以殼聚糖等為原料，經過縮合反應得到四種殼聚糖席夫堿衍生物，通過微量液體稀釋法和真菌菌絲生長速率法測定4種衍生物對灰霉菌均有明顯抑制作用。曾利等［16］合成的菲醌-甘氨酸希夫堿金屬配合物，對大腸桿菌表現一定的抑制作用。隨著人們對席夫堿類化合物抗菌活性的了解，關于席夫堿殺菌抗菌活性方面的性能研究也將越來越受到重視。本研究擬合成基于苯甲酰肼的新型席夫堿化合物，并對其與金屬絡合后對香蕉枯萎病菌的抗菌活性進行研究，設計合成對尖孢鐮刀菌抑菌活性良好的席夫堿衍生物，以期為海南香蕉枯萎病的化學防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

尖孢鐮刀菌生理4號小種（Foctropical race 4，FocTR4）（由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供）。

1.1.2 試劑

DMSO（阿拉丁）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（青島海博）、鄰氨基苯甲酰肼（阿拉丁）、乙醇（西隴科學）、2-噻吩甲醛（阿拉丁）、2-吡啶甲醛（阿拉丁）、水楊醛（阿拉丁）、甲醇（百靈威）、氯化汞（天津利密歐）、氯化銅（天津利密歐）、硝酸鋅（天津利密歐），以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 化合物的合成路線

在理論計算和分子識別指導下，有針對性地進行設計，并利用組合化學的相關知識篩選有效化合物，選擇設計合成3種席夫堿化合物，并將之分別對應的與3種金屬離子絡合。合成路線如圖1。

圖1 化合物 11～ 66的合成路線

1.2.2 系列一化合物的合成

分別稱量0.491 4、0.501 1、0.486 6 g鄰氨基苯甲酰肼加入3個已有40 mL乙醇的100 mL規格的單口燒瓶中，加入磁子攪拌，再分別加入2-噻吩甲 醛（727.76 μL， 7.80 mmol）、 2-吡 啶 甲 醛（772.38 μL，7.96 mmol）、水楊醛（822.72 μL，7.73 mmol），緩慢升溫至75oC左右，攪拌回流8 h，冷卻反應溶液，旋轉蒸干乙醇。加入少量水，此時溶液渾濁出現大量沉淀，抽濾，水洗濾餅3次，真空干燥，依次得到目標產物。

化合物1：淡黃色。MS（ES+）m/z：336.18［M+1］+.1H NMR（δ：ppm，CDCl3）：8.98（s，1H），8.68（d，1H，J＝5.00），8.67（d，1H，J＝5.00），8.08（d，1H，J＝8.00），8.00（d，1H，J＝8.00），7.73（t，1H，J＝7.50），7.60（t，1H，J＝7.77），7.28（t，3H，J＝7.02），7.20（t，1H，J＝6.28），6.88（t，1H，J＝7.40），6.72（d，1H，J＝8.45），6.38（s，1H），5.85（s，1H）.13C NMR（δ：ppm，CDCl3）：161.33，158.64，155.91，150.27，149.97，149.53，145.24，137.01，136.45，134.29，129.13，124.28，121.24，120.74，119.84，116.19，115.37.

化合物2：黃色。MS（ES+）m/z：329.06［M］+.1H NMR（δ：ppm，CDCl3）：9.04（s，1H），8.63（d，1H，J＝5.00），8.61（d，1H，J＝5.00），8.04（d，1H，J＝8.00），8.00（d，1H，J＝8.00），7.73（t，1H，J＝7.50），7.60（t，1H，J＝7.75），7.28（t，3H，J＝7.00），7.20（t，1H，J＝6.25），6.86（t，1H，J＝7.50），6.70（d，1H，J＝8.50），6.37（s，1H），5.83（s，1H）.13C NMR（δ：ppm，CDCl3）：161.33，157.64，153.91，150.27，149.97，149.53，145.24，137.01，136.45，134.29，129.13，124.28，123.45，121.24，120.74，119.82，116.15，115.35.

化合物3：白色。MS（ES+）m/z：360.20［M+H］+，382.31［M+Na］+.1H NMR（δ ppm，DMSO-d6）：11.44（s，1H），10.24（s，1H），8.45（s，1H），7.80（d，1H，J＝7.72），7.48（s，1H），7.39（d，1H，J＝7.40），7.30（d，1H，J＝7.12），7.27（d，1H，J＝7.20），7.13（t，1H，J＝7.38），6.97（d，1H，J＝7.60），6.92（d，1H，J＝7.32），6.89（s，1H），6.87（d，1H，J＝7.64），6.83（d，1H，J＝7.56），6.76（d，1H，J＝7.36），6.72（d，1H，J＝10.24），6.68（d，1H，J＝7.48）.13C NMR（δ ppm，DMSO-d6） ：161.21，158.51，155.63，150.64，147.28，135.14，132.50，131.38，130.78，129.00，126.90，125.08，120.12，119.93，119.24，118.54，117.48，116.75，115.79，114.11.

1.2.3 系列二化合物的合成

分別將71.8 mg的化合物1（339.47 g/mol）、化合物 2（329.47 g/mol）、化合物 3（359.47 g/mol）溶于15 mL甲醇中，置于25 mL容量瓶中，再分別加入 HgCl2（0.1183 g，4.36 mmol）、CuCl2·2H2O （0.0743 g， 4.36 mmol）、 Zn （NO3）2·6H2O（0.1188 g，3.99 mmol），抽濾，水洗濾餅3次，真空干燥，依次得到系列二化合物4（淡黃色）、化合物5（綠色）、化合物6（白色）。

1.2.4 體外抗真菌活性測試

抗菌劑的配制：離心管滅菌后對應相應藥品的編號，用天平稱取0.01 g藥品，分別投加到相應的離心管，在無菌操作臺，用微量注射器加入1 mL DMSO，搖勻，用封口膜封好，存放冰箱待用。

帶毒培養基的配制：滅菌后的培養基待溫度降至60℃左右時，在無菌工作臺中用無菌槍頭加入抗菌劑至培養基，輕輕振蕩搖勻制成4 mg/100 mL的帶毒培養基，倒入直徑為9 cm的無菌平板中，并在平板上做好相應編號，空白對照只加DSMO試劑，平板放靜置0.5 h待完全冷卻后，置于28℃恒溫培養箱，倒置培養24 h，備用。

接種培養：在無菌操作臺中用滅菌好的直徑5 mm打孔器對生長好的尖孢鐮刀菌生理4號小種平板進行打孔，隨后用無菌鑷子將菌餅接種到帶毒平板和空白對照平板上，并記錄接種時間。將接種好的平板放在28℃恒溫箱中倒置培養。

結果記錄：平板培養72、96、120 h后分別量取菌落直徑（按十字交叉法，每個菌落量2次，取其平均數），同時拍照記錄。

將處理菌落和空白組進行直徑對比，求得抑制百分率。

2 結果與分析

2.1 系列一衍生物對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抗菌活性研究

合成的1～3號化合物物對尖孢鐮刀菌的抑制效果如圖2所示，在菌落生長初期，殺菌劑對菌的抑制效果較好，隨著時間的推移，抑制效果降低。在72 h時，化合物1、2、3抗菌效果最好，分別達到14.7%、10.7%、16.0%，而96、120 h則有所下降并基本保持穩定，且能保持持久的作用效果，這種現象可能是由于尖孢鐮刀菌生理4號小種在5 d左右基本長成。總體來說，化合物3號對尖孢鐮刀菌生理4號小種抑制效果最好，化合物1號次之，化合物2號也有一定的抗菌效果，1、2號抗菌活性不是很高，原因可能是2-噻吩甲醛、2-吡啶甲醛分別具有S-、N-，以及醛基等吸電子基團，使得抑菌效果不明顯。綜上所述，系列一衍生物對尖孢鐮刀菌生理4號小種的最佳抗菌條件在投藥72 h后，抗菌劑濃度為4 mg/100 mL時，3種抗菌劑對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抑制率依次為：化合物3號＞1號＞2號。

2.2 系列二衍生物對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抗菌活性研究

從圖3數據可以看出，系列一衍生物在和金屬離子絡合后所形成的系列二衍生物，在72 h時抗菌活性較強，隨后有所下降，而在120 h時開始上升，且抑菌效果最好，可分別達到12.7%、14.1%、14.1%。其中與鋅離子絡合而成的化合物6號對尖孢鐮刀菌抑制效果最好。相同條件下，72和96 h系列二衍生物抗菌活性均比系列一衍生物要低，而120 h時則相反，說明在120 h時間段為該類席夫堿金屬配合物的最佳抑菌活性反應時間。綜上所述，系列二衍生物對尖孢鐮刀菌生理4號小種的最佳抗菌條件在投藥120 h后，抗菌劑濃度為4 mg/100 mL時，3種抗菌劑對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抑制率依次為：化合物6號＞5號＞4號，添加金屬離子修飾后，抑菌效果沒有顯著增加，后續需進行金屬離子的重新修飾，從而達到抑菌效果的顯著增加。

圖2 系列一化合物的對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抗菌活性曲線

圖3 系列二絡合物的對尖孢鐮刀菌生理4號小種的抗菌活性曲線

3 討論與結論

3.1 討論

在化學防治方面，常用的廣譜殺菌劑多菌靈等被報道在實驗條件下對香蕉枯萎病菌都有較好的抑制效果，但田間防治效果較差［17］，此外，楊雙昱等［3］研究表明，戊二醛作為防治香蕉枯萎病菌的土壤消毒劑，對抑制香蕉枯萎病也具有一定效果，但都局限于盆栽實驗，田間防治效果還有待進一步提高。所以，開發新型的高效化學殺菌劑，提高其對尖孢鐮刀菌的抑菌效果顯得迫在眉睫。與市場上成熟的殺菌劑的殺菌效果相比，本研究合成的殺菌劑抑菌效果較差［1］，但席夫堿配合物對尖孢鐮刀菌的抑菌活性等到證實。同時，席夫堿可靈活巧妙的選擇胺類化合物和羰基來反應，可通過改變功能基團從而實現衍生化［18］。另外，席夫堿結構中常含有高電負性的O、S、P等原子，而且甲亞胺上的N原子上有孤對電子，在一定的條件下容易與金屬形成配合物，而其中的某些配合物具有良好的抗菌、抗腫瘤、抗炎等藥理作用，席夫堿金屬配位化合物所呈現出廣泛的生物活性［19］。下一步將對合成的席夫堿類衍生物進行進一步的優化與修飾，以實現其對尖孢鐮刀菌高效抑制，為實現香蕉枯萎病的化學防治提供支持。

3.2 結論

本研究合成基于苯甲酰肼的6個席夫堿化合物，通過菌絲生長抑制試驗，考察了其對尖孢鐮刀菌的抑菌效果，結果表明6個新合成的化合物均對尖孢鐮刀菌有一定的抑制效果。其中3號化合物對尖孢鐮刀菌的抑制效果最好，4 mg/100 mL濃度下，72 h時的抑制率達到16.0%，表現出一定的抑菌活性。