陜西一養豬場4種細菌的流行狀況及分型研究

柳江山,黎 娜,張金蕾,張 倩,楊 俊,彭子欣,李鳳琴,葛武鵬,楊保偉

(1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022)

21世紀以來，細菌污染食品所導致的食源性疾病爆發已成為全球性公共衛生問題[1]。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、部分致病性大腸桿菌和腸球菌都是常見的人畜共患病病原菌，能夠以食品為載體進入人體，嚴重威脅食品安全，給人類健康帶來隱患。

隨著我國經濟的不斷發展和人民生活水平的提高，人們對各種畜禽產品的需求量日益增加，這也直接促進了我國畜禽養殖業的發展。就養豬產業而言，各種大規模的養殖場不斷建成，豬場規模越來越大，存欄數越來越多。流行于豬場的沙門氏菌等致病菌不僅會對養豬業造成很大的危害，而且也會對食品安全產生一定的影響[1, 2]。近年來，由于養豬場規模的擴張，豬場環境中的細菌分布發生了很大變化，空氣、水、土壤、糞便等環境中的細菌種類變多，數量增大，部分致病性細菌已經擴散[3]。其中，由糞便污染引起的人畜共患病的傳播與感染已經引起人們廣泛關注。有研究表明，畜禽糞便中大約有150種人畜共患病致病源；畜禽養殖場的污水中，大約每毫升含有超過30萬大腸桿菌和65萬腸球菌[4]。生豬作為大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌的宿主，一方面可以通過人畜接觸將這些細菌直接傳遞給人類；另一方面，這些細菌也可隨動物排泄物、養殖污水、氣溶膠等介質污染環境，進而通過食物鏈傳播給社區人群。因此，筆者研究旨在對豬源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌等病原菌進行調查研究，為豬場合理防治病原菌提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 按照國家食品安全風險評估中心“動物源食物鏈中耐藥性細菌污染和傳遞機制研究工作方案”規定，2015年12月和2016年4月，分別于生豬育肥前期(50～90日齡)和育肥后期(120～130日齡)從陜西省扶風縣某豬場4個豬舍采集豬糞樣品20份、豬鼻拭子20份、豬舍地面涂抹樣品12份、豬舍墻壁涂抹樣品12份、土壤樣品4份、水體樣品3份、養殖人員糞便樣品4份等共150份樣品。該豬場母豬存欄數為20頭，豬舍30個，養殖在欄仔豬和育肥豬約300頭。

1.1.2 培養基 緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)、四硫磺酸鈉亮綠培養基基礎(Tetrathionate Broth，TTB)及添加劑、EC肉湯、mEI培養基、Luria—Bertani(LB)營養瓊脂、Rappaport—Vassiliadis(RV)肉湯、Mueller Hinton(MH)瓊脂、麥康凱瓊脂、腦心浸液瓊脂和腦心浸液肉湯培養基均購自北京陸橋技術股份有限公司；XLT4培養基基礎及添加劑購自美國BD公司。PCR用Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer、MgCl2均購自寶生物工程(大連)有限公司。細菌檢測和分型用引物由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將拭擦獲取墻壁和地面涂抹樣品的海綿頭裝入無菌采樣袋，向采樣袋中加入10 mL無菌BPW，用拍擊式均質器快速拍打30 s。豬鼻拭子樣品從運送培養基中取出后，用無菌剪刀剪下拭子頭，置于裝有10 mL無菌BPW的試管中渦旋振蕩30 s。取污水、人/豬糞便樣品各25 mL(g)加入裝有225 mL BPW的均質袋中，用拍擊式均質器快速拍打1 min。土壤樣品混勻后，稱取25 g加入裝有225 mL BPW的均質袋中用拍擊式均質器快速拍打1 min。

1.2.2 細菌的分離、鑒定與分型 主要有:

(1)大腸桿菌的分離和鑒定。按照國家食品安全風險評估中心“動物源食物鏈中耐藥性細菌污染和傳遞機制研究工作方案”中規定的方法進行。吸取1 mL 混勻的BPW樣品懸液，加入裝有9 mL EC肉湯的試管中，37 ℃增菌培養16～20 h后，觀察EC肉湯管中的倒置玻璃管是否有氣泡產生，有氣泡產生者為陽性，繼續后續實驗。無氣泡產生為陰性管，停止實驗。

用接種環取陽性管中菌液1環，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養18～24 h；挑取3～5個大腸桿菌疑似菌落，于麥康凱瓊脂培養基上再純化1次，37 ℃培養18～24 h；挑取2次純化后的疑似菌落接種在MHA平板上，37 ℃培養18～24 h。

用無菌接種環挑取MHA平板上的培養物制作模板，進行PCR鑒定。PCR鑒定中大腸桿菌ATCC25922用作陽性對照。PCR反應體系為：總體積25 μL，PreMix10 μL，正向引物(50 pM·mL-1)0.3 μL，反向引物(50 pM·mL-1)0.3 μL，ddH2O 12.4 μL，模板DNA 2 μL。大腸桿菌鑒定用引物如表1所示。

PCR反應條件：95 ℃ 預變性6 min；95 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 0.5 min 30個循環；72 ℃ 7 min 。PCR產物電泳后，與標準菌株相比，若供試菌的擴增結果同在450 bp處出現目標條帶則為陽性菌株。PCR陰性擴增結果重復3次，如仍均為陰性，判斷結果為陰性。

(2)大腸桿菌分型。采用多重PCR檢測腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli; EHEC)、腸致病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli; EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli; ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveEscherichiacoli; EIEC)和腸聚集性大腸桿菌(EnteroaggregativeEscherichiacoli; EAEC)在大腸桿菌分離株中的流行狀況。

使用12種基因用于5類大腸桿菌的分型和檢測，具體為：EPEC(escV、bfpB)、EHEC(stxlA、stx2A、escV )、ETEC(elt、estIa、estIb)、EIEC(invE)和EAEC(astA、aggR、pic)[5]。PCR反應體系、條件和陽性結果判定同(1)大腸桿菌PCR檢測，擴增中退火溫度隨所用引物而定。

不同亞型大腸桿菌判定標準：bfpB和escV 2個基因同時擴增陽性可判定為典型EPEC，僅有escV基因為不典型EPEC；stx1、stx2或escV任一基因陽性即判定為EHEC；elt和/或estla基因陽性，estlb陽性可判定為ETEC，僅estlb陽性也可判定為ETEC；invE陽性即可判定為EIEC；pic、aggR、astA中任一基因陽性、兩兩組合或者全部陽性均可判定為EAEC。

1.2.3 腸球菌分離、鑒定和分型 主要有:

(1)腸球菌的分離和鑒定。吸取1 mL BPW樣品懸液，加入裝有9 mL腸球菌增菌肉湯的試管，37 ℃培養20～24 h進行選擇性增菌。取1環腸球菌增菌液，劃線接種于mEI平板，37 ℃培養40～48 h。每個平板挑取帶有藍黑色暈輪的疑似菌落3～5個，不足3個疑似菌落的平板，將疑似菌落全部挑取進行驗證。疑似菌落在MHA培養基上劃線純化，37 ℃培養18～24 h后挑取MHA平板上的培養物制備模板，進行PCR鑒定。PCR反應體系和條件同1.2.1(1)大腸桿菌PCR檢測，退火溫度因引物序列而定。糞腸球菌ATCC29212用作腸球菌PCR鑒定的陽性對照菌株，與標準條帶相比，若疑似菌的擴增產物在112 bp處出現目標條帶則為陽性菌株。

(2)腸球菌分型。采用PCR對腸球菌分型(表2)[6]。PCR反應體系和條件同1.2.2(1)大腸桿菌PCR檢測，退火溫度如表2所示。

表1 大腸桿菌鑒定和分型用引物及相應擴增片段大小

表2 腸球菌鑒定和分型用引物及相應擴增片段大小

1.2.4 沙門氏菌分離、檢測和分型 主要有:

(1)沙門氏菌分離和檢測。分別吸取1 mL BPW樣品懸液，加入裝有9 mL RV和SC增菌液的離心管中，振蕩均勻后RV肉湯于42 ℃培養18～24 h，SC肉湯于37 ℃培養18～24 h。分別取1環RV和SC增菌液，劃線接種XLT4平板，37 ℃培養24～48 h，挑取疑似菌落。疑似菌落在XLT4培養基上再次純化后，劃線LB平板，37 ℃培養18～24 h。挑取LB平板培養物制作模板進行PCR鑒定。鑒定中Salmonella typhimurium LT2用作陽性對照，PCR反應體系和條件同1.2.2(1)大腸桿菌PCR檢測。引物分別為invA-F：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’和invA-R：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’。

(2)沙門氏菌血清分型。采用玻片凝集法對沙門氏菌進行血清分型。使用泰國S&A公司生產的沙門氏菌診斷血清，按照沙門氏菌血清診斷操作步驟進行，查閱S&A公司沙門氏菌抗血清診斷附錄和沙門氏菌檢驗國家標準(GB/T4789.4-2016)，根據測定得到的抗原確定沙門氏菌的血清型。

1.2.5 金黃色葡萄球菌的分離、檢測和分型 主要有:

(1)金黃色葡萄球菌的分離和檢測。吸取1 mL BPW樣品懸液，加入9 mL 7.5% NaCl肉湯，37 ℃培養16～20 h。取1環增菌液劃線接種于Baird-Parker平板，37 ℃培養36～48 h。挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落，劃線于血平板上，37 ℃培養18～24 h，觀察菌落是否產生溶血圈。如菌落周圍可見完全透明溶血圈，則判定為陽性結果。同時進行PCR鑒定，鑒定時使用nuc1和nuc2作為引物、ATCC29213作為陽性對照。PCR反應體系和條件同1.2.2(1)大腸桿菌PCR檢測條件。與陽性對照菌目標基因擴增條帶相比，若疑似菌在694 bp處出現目標條帶則為陽性菌株(表3)。

(2)金黃色葡萄球菌SPA和MRSA分型。采用PCR結合DNA序列測定對金黃色葡萄球菌進行SPA和MRSA分型。PCR所用引物如表3所示，PCR反應體系和條件如1.2.2(1)。

表3 金黃色葡萄球菌鑒定、SPA分型和MRSA分型用引物及相應擴增片段大小

1.2.6 數據處理 用Minitab進行數據處理, 通過χ2檢驗比較檢出陽性率,P<0.05有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 種細菌在豬育肥前期和后期的檢出狀況

在采集的150份樣品中，4種細菌均有不同程度檢出。其中，腸球菌陽性樣品檢出率最高(81.3%)，其次分別為大腸桿菌(66.7%)、沙門氏菌(22.7 %)和金黃色葡萄球菌(6.67 %)陽性樣品。

育肥前期采集的75份樣品中，腸球菌陽性樣品檢出率為89.3%，顯著(P<0.05)高于育肥后期樣品中該菌陽性樣品的檢出率(73.3%)。育肥前期沙門氏菌陽性樣品檢出率(38.7%)顯著(P<0.05)高于育肥后期(6.67%)，育肥前期金黃色葡萄球菌檢出率(12.0%)也顯著(P<0.05)高于育肥后期(1.33%)。育肥前期大腸桿菌陽性樣品的檢出率(69.3 %)與育肥后期(64.0 %)無顯著性差異。

總體來看，4種細菌在生豬育肥前期所采樣品中的檢出率均高于后期，除大腸桿菌外，其余3種細菌在豬育肥前、后期的檢出率間均存在顯著性差異。

2.2 種菌在不同類型樣品中的檢出狀況

育肥前期采集的樣品中，污水中大腸桿菌陽性樣品的檢出率為100 %，其它依次為豬鼻(90.0%)、豬糞(80.0%)、墻壁(66.6%)、地面(41.6%)、人糞和土壤(25.0%)。育肥后期大腸桿菌在污水中的檢出率仍然最高(100%)，其它分別為豬糞(90.0%)、地面(83.3%)、人糞(75.0%)、豬鼻(60.0%)和墻壁(16.6%)，未在土壤中檢出大腸桿菌。除污水外，大腸桿菌陽性樣品在豬育肥前期和后期采集樣品中的檢出率均存在顯著性(P<0.05)差異。

育肥前期，腸球菌陽性樣品在地面、土壤和污水中的檢出率均為100%，在其它樣品中的檢出狀況分別為墻壁(91.6%)、豬糞(90.0%)、豬鼻(65.0%)和人糞(50.0%)。育肥后期，人糞和污水中檢出率為100%，其它依次為豬糞(90.0%)、地面(83.3%)、墻壁(66.6%)和豬鼻(55.0%)，土壤中檢出率最低(25.0%)。除污水和豬糞以外，腸球菌在育肥前、后期采集的其它樣品中的檢出率間均存在顯著性差異。

圖1 4種細菌在生豬育肥前期和后期不同樣品中的檢出率

育肥前期沙門氏菌陽性樣品在污水中的檢出率最高(66.6 %)，其次是豬糞(30.0%)、地面(33.3%)和豬鼻(30.0%)，在墻壁、人糞和土壤樣品中的檢出率均為25.0%。育肥后期豬糞中沙門氏菌陽性樣品檢出率最高(15.0%)，其次為墻壁(8.30%)和豬鼻(5.00%)，未在其它樣品中檢出沙門氏菌。沙門氏菌陽性樣品檢出率在育肥前期和后期采集樣品中均存在顯著性(P<0.05)差異。

金黃色葡萄球菌陽性樣品在育肥前期采集的墻壁涂抹樣品中檢出率最高(16.6%)，其次分別為豬糞(15.0%)和地面樣品(8.3%)。只在育肥后期采集的地面樣品中檢出金黃色葡萄球菌(8.3%)。

2.3 大腸桿菌、腸球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分型

85株大腸桿菌中，43株大腸桿菌使用PCR和本研究所用引物未能分出型別，在可分型菌株中EAEC的檢出率最高(40.0%)，其次分別為ETEC(7.06%)、EPEC(1.17%)和EIEC(1.17%)，未檢出EHEC。

87株腸球菌可分為4個亞型，其中糞腸球菌50株(58.62%)，屎腸球菌9株(9.2%)，雞腸球菌4株(4.6%)，其它類型腸球菌24株(27.58%)。

血清分型結果表明33株沙門氏菌均為鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)。

7株金黃色葡萄球菌中，檢出1株(14.3%)MRSA，該菌分離自豬糞，SPA型為T441。其余6株金黃色葡萄球菌中有2株T701型，T189型和T899型各1株，2株無法分型。

3 討 論

研究表明，該豬場的環境、豬體和飼養員糞便樣品中均有4種細菌檢出，而且檢出率較高。在生豬育肥前、后期采集的150份樣品中，腸球菌陽性樣品檢出率為81.3%，大腸桿菌為66.7%，沙門氏菌為22.7 %。雖然金黃色葡萄球菌陽性樣品檢出率較低，但仍達6.67 %。

陳茹[7]研究表明，2014年10月至2015年4月，陜西省一規模化豬場中大腸埃希菌(100%)、葡萄球菌(9.3%)和沙門氏菌(2.33%)均有不同程度的流行。李楠等[8]于2010年從吉林省某豬場檢出的大腸桿菌陽性樣品率為17.4%，雖然檢出率較低，但大腸桿菌仍是多種細菌陽性樣品檢出率中最高者。這些研究結果均與筆者研究類似，表明大腸桿菌在豬場中普遍存在，且檢出率較其它菌株高。

4種細菌在豬育肥前、后期的檢出率有所不同。對于該豬場來講，育肥前期(冬季)檢出率總體上大于育肥后期(春季)，除大腸桿菌之外，其它3種細菌在育肥前期和后期的檢出率間均存在顯著性差異。根據我們的實地調研和飼養員分析，這可能是因為陜西地處關中地區，冬季天氣寒冷，為了保溫，豬舍窗戶開啟時間短，通風效果不好，舍內溫度、濕度升高后營造出了適宜細菌生長繁殖的環境條件。而春季豬舍內通風良好，環境相對干燥，不適宜大多數細菌生長，因此育肥前期的檢出率較高。

研究表明，該豬場豬源大腸桿菌以EAEC為主，這與浙江工業大學2014年對杭州地區豬場中大腸桿菌的分型結果[9]類似，其結果顯示豬場中EAEC檢出率最高(22.1%)，其次為ETEC(1.47%)，未檢出EPEC。EAEC感染是發展中國家腹瀉的重要病因之一。巴西的研究數據表明，EAEC感染是小兒腹瀉最常見的病因，在<2歲的兒童中，EAEC與發病具有較高的相關性[10]。此外，EAEC還與旅行者腹瀉相關。在美國，EAEC是繼ETEC之后，導致成年旅行者腹瀉的第2大病原菌，在去墨西哥旅游的美國成年人中，雖然大多數人無腹瀉癥狀，但48%的人出現了抗集聚蛋白Dispersin抗體的升高[11]。墨西哥一項有關餐桌調味品的調查中發現，在44%的調味品中可檢測到EAEC[12]。伊朗的研究[13]發現，140例腹瀉兒童病例中，有15例(10.7%)由EAEC感染導致。EAEC所導致的腹瀉在孟加拉國和中非也有很高的發病率[14, 15]。我國是豬肉生產大國，豬肉也是我國消費者最主要的食用肉品之一，在豬場中大量檢出的致病性大腸桿菌非常有可能隨著生豬屠宰、分割和銷售等環節進入消費者的餐桌，導致食品安全事件發生。

此外，筆者研究結果表明所調查豬場中糞腸球菌占比最高(58.62%)，屎腸球菌較少(9.62%)，其它類型的腸球菌占比27.58%。其它類型腸球菌中主要包含了不常見的腸球菌亞型，即：鳥腸球菌、酪黃腸球菌、堅忍腸球菌、惡臭腸球菌、芒地腸球菌和希拉腸球菌等共6種。這與董鵬等[16]對河南省4個地區規模化豬場豬肛門拭子樣品中糞腸球菌的研究結果(51.33%)比較類似。王送林[17]從湖南省部分豬場健康豬腸道內共分離到腸球菌115株，其中糞腸球菌11株，屎腸球菌59株，其他腸球菌45株，表明湖南省豬源腸球菌以糞腸球菌和屎腸球菌為主，只是屎腸球菌更為普遍，與筆者研究分型結果略有不同。與趙麗青等[18]報道的省青島地區動物源糞腸球菌檢出率(76.90%)，幸文定[19]報道的江西省7個地區豬源糞腸球菌檢出率(64.80%)相比，筆者研究中糞腸球菌檢出率略低，這可能是由于筆者研究中所采集的樣品除糞便外，還有環境樣品等原因有關。

筆者研究中，分離到的沙門氏菌血清型均為鼠傷寒，血清型單一。中國動物衛生與流行病學中心李月華等[20]對2012-2017年分離自山東等6省份的89株豬源沙門氏菌進行了血清型鑒定，結果顯示豬源菌株以鼠傷寒(58.43%)、腸炎(12.36%)、印第安納(11.24%)和德爾卑(7.87%)為主。過效民[21]的研究結果則顯示從河南省鄭州、開封、焦作和許昌4個地市生豬屠宰場檢出的沙門氏菌以德爾卑沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主。在四川省豬調查的結果表明豬源沙門氏菌血清型以德爾卑為主(60.26%)，其次是鼠傷寒(16.56%)和羅森(6.60%)[22]。在哈爾濱卻以豬霍亂(71.40%)血清型為主，其次為豬傷寒(22.90%)和鼠傷寒(5.70%)[23]。與現有研究結果相比，可發現豬源沙門氏菌的主要血清型受地域影響較大，隨地域不同而有所不同，但在各地豬源沙門氏菌中均有鼠傷寒沙門氏菌檢出。

7株金黃色葡萄球菌中有1株MRSA檢出。2013年，中國食品藥品檢定研究院研究發現，養殖生豬是MRSA的重要宿主[24]。該研究還顯示，2013年河北省檢出MRSA 28株(25.0%)，湖北省檢出16株(12.1%)，陜西省檢出12株(8.51%)，四川省檢出2株(1.60%)。這表明，在我國，豬場MRSA檢出率并不高，且在地區間MRSA檢出狀況不同。結合筆者研究的數據可以看出，陜西省豬源MRSA分布與其他省份相比并不廣泛。另外，雖然筆者研究中只分離到7株金黃色葡萄球菌，但卻涵蓋了4種SPA型，分別是T701型(2株)、T441型(1株)、T189型(1株)和T899型(1株)，剩余2株暫未分出SPA型，表明陜西省豬源金黃色葡萄球菌SPA型的多樣性較高。而中國食品藥品檢定研究院的研究顯示，從4個省31個養豬場和2個豬屠宰場中獲得的58株MRSA均屬于同1個spa型(07-16-23-02-34，t899)，與本研究結果有所不同。

綜上，筆者研究所調查的豬場中4種細菌分布較為廣泛，型別相對較多，且檢出很多致病性型別的菌株。該4種細菌可能會給生豬養殖、豬肉產業鏈和豬肉安全健康發展帶來潛在的安全隱患，所以，應結合研究結果對豬場加強管理，控制細菌的生長和污染，從源頭上為豬肉食品安全把關。