硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ葉綠素熒光特性的影響

羅麗娟，唐莉娜，陳星峰，李 延*

1. 福建農林大學資源與環境學院，福州市倉山區洪山橋上下店路15 號 350002

2. 福建省土壤環境健康與調控重點實驗室，福州市倉山區洪山橋上下店路15 號 350002

3. 福建省煙草公司煙草科學研究所，福州市五四北路306 號 350003

鎘是生物毒性最強的重金屬元素之一，遷移性強，是我國耕地土壤重金屬污染最主要元素[1]，其超標率居土壤無機污染物的第一位[2]。鎘可通過食物鏈進入人體，并在人體中積累進而對人體產生危害。由于煙草對鎘的吸收富集能力強[3]，而煙草體內的鎘主要來源于土壤[4]，因此土壤鎘污染會導致煙草產量和品質降低[5]。研究表明，鎘可通過煙氣進入人體，人體中鎘含量會隨吸煙年限的增加而提高[6]。因此，鎘污染對煙草生長的影響研究被廣泛關注。硅是土壤和地殼中含量最豐富的元素之一，作為高等植物中重要的無機組成成分，被公認為植物體的有益元素。大量研究表明，硅可通過改善植物光合性能來提高植物對逆境脅迫（重金屬[7-9]、鹽脅迫[10]、干旱[11]）的抗性。近年來，已有研究發現，施硅可以緩解鎘脅迫對植物葉片光系統Ⅱ的影響，高雨等[12]研究提出，施用硅酸鈉可以提高鎘脅迫下鋪地竹對光能的吸收利用能力，維持較高的電子傳遞速率，緩解光抑制作用，但該研究未排除硅酸鈉的加入，引起介質pH 升高對鎘毒性的影響。馮建鵬[13]研究表明，施用硅素可提高鎘毒害下黃瓜幼苗的光反應中心活性，但該試驗中利用硫酸來調節營養液的pH，不能排除調節pH 時SO42-的加入對鎘有效性的影響，因有研究表明硫可以提高植物對鎘脅迫的耐性[14]。上述研究結果均不能準確反映硅能提高鎘脅迫下的植物PSⅡ反應活性這一觀點。而目前有關硅對鎘脅迫下煙草PSⅡ熒光參數的影響鮮見報道。因此，通過水培試驗，利用葉綠素熒光動力學技術分析了硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ的影響，探討硅在緩解煙草鎘脅迫下的光合生理機制，以期為煙草合理施用硅肥、防治鎘污染提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗設置在福建農林大學資源與環境學院盆栽房（自然光、溫條件）。參照鄭明瑜等[8]的試驗方案，以云煙87 為供試煙草品種進行室內水培試驗，選取基質育苗6 葉齡且長勢一致的煙苗，將煙苗根系洗凈后，移栽至裝有9 L Hoagland 完全營養液的聚乙烯塑料桶中，用具孔的塑料板通過海綿固定煙苗，每桶種植4 株，培養3 周后間苗至2 株，同時進行鎘、硅處理。在前期預備試驗的基礎上，設置5 個處理，分別為對照（CK）、0.05 mmol·L-1Cd2+（Cd0.05）、0.10 mmol·L-1Cd2+（Cd0.10）、0.05 mmol·L-1Cd2++1.00 mmol·L-1SiO2（Cd0.05+Si）、0.10 mmol·L-1Cd2++1.00 mmol·L-1SiO2（Cd0.10+Si），每處理3 次重復，每重復2 株煙苗。以CdCl2·2.5H2O 作為鎘源，K2SiO3作為硅源，K2SiO3引入的鉀離子通過調節營養液中KNO3濃度來消除，而由此引起的NO3-損失用1 mol·L-1HNO3補充，使各處理的氮、鉀離子濃度保持一致。試驗期間采用電動泵每隔2 h 通氣1 h，每2 d 用1 mol·L-1HCl、1 mol·L-1NaOH 調 節pH，使營養液pH 保持在6.0±0.2 范圍內。

1.2 測定方法

煙株生長至團棵期時，選取煙株從上往下數的第4 片葉，參照吳敏蘭等[15]的方法測定葉綠素熒光參數，采用英國Hansatech 公司的Handy PEA植物效率儀測定葉綠素熒光參數，并記錄葉綠素熒光誘導動力學曲線的快相部分。

1.3 數據處理

用Handy PEA 植物效率儀自帶的軟件PEA Plus 1.0 將測定各個處理的熒光數據導入Excel 表，參照Han S 等[16]的方法計算熒光參數，見表1。并利用Excel 表和SPSS 19 軟件進行數據處理與分析。其中，利用SPSS 19 軟件進行單因素方差分析和數據間差異的顯著性比較（Duncan 法），顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與討論

2.1 硅對鎘脅迫下煙草葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響

將經過充分暗適應的葉片突然暴露在可見光下，會呈現熒光隨時間變化的曲線，該曲線一般包含O、I、J、P 4 個特征位點，即快速葉綠素熒光誘導動力學曲線（OJIP 曲線）。OJIP 曲線可直觀反映植物受到逆境傷害的程度[17]。如圖1 所示，鎘脅迫下煙草葉片OJIP 曲線發生變化，J-I-P 相降低，最大熒光值下降，Cd0.10處理出現K 相升高；圖2顯示，鎘脅迫下最小熒光值（Fo）顯著降低，表明鎘脅迫下煙草葉片光合機構受到破壞。加入硅處理后，曲線O-I-P 相熒光值升高，接近CK 水平，Cd0.10+Si 處 理 的 曲 線K 相 消 失，Fo恢 復 到CK 水平。表明硅處理可以緩解鎘對煙草葉片光合機構的影響。

圖1 硅對鎘脅迫下煙草葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響Fig.1 Effects of silicon on fast chlorophyll fluorescence induction dynamics curve of tobacco leaves under cadmium stress

圖2 硅對鎘脅迫下煙草葉片初始熒光值和最大熒光值的影響Fig.2 Effects of silicon on Fo and Fm of tobacco leaves under cadmium stress

表1 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線OJIP 分析中使用的熒光參數及定義Tab.1 Fluorescence parameters and definitions used in fast chlorophyll fluorescence induction dynamics curve（OJIP）

2.2 硅對鎘脅迫下煙草葉片可變熒光和光化學效率的影響

由表2 可知，與CK 相比，Cd0.05和Cd0.10處理的可變熒光（Fv）分別降低了4.48%和11.03%，差異顯著；Cd0.05處理的最大光化學效率（Fv/Fm）和潛在光化學效率（Fv/Fo）差異不明顯，Cd0.10處理的Fv/Fm和Fv/Fo顯著降低。表明較低鎘濃度處理對煙草葉片光化學效率的影響不明顯，而較高鎘濃度處理導致煙草葉片光化學效率受到抑制。Fv/Fm在Cd0.05處理時變化不大，但Fv和Fm的變化顯著，這可能是由于部分葉綠體超微結構的改變引起的。有研究表明，類囊體發生腫脹、高度破壞，光合合成單位及膜結合電子傳遞進程也會受到破壞，即使Fv/Fm沒有或很小變化，初始熒光參數也會受到葉片結構狀態的影響[18]。加硅處理后，Fv較脅迫處理顯著增加，Fv/Fm和Fv/Fo在Cd0.05+Si 處理時略有上升，在Cd0.10+Si 處理時顯著增加，這可能是由于加硅處理使葉綠體超微結構變得完整[9]，提高了煙草葉片Mg 的含量[19]，使鎘脅迫條件下煙草葉片的光合色素含量增加[8]，進而有利于光化學效率的提高。

2.3 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ供體側的影響

相對可變熒光ΔVt的分析結果（圖3）表明，鎘脅迫下，在0.3 ms 特征位點處出現K 相的正向升高（ΔK＞0），葉綠素熒光值增加明顯，K 相的出現主要是由于電子傳遞鏈中水的裂解過程被抑制和電子初級醌受體（QA）部分被抑制所造成的，可以作為放氧復合體（OEC）受損的特殊標記[20]。也表明從Cd0.05處理到Cd0.10處理，葉片PSⅡ供體側受到的傷害程度逐漸增加，逐漸減弱了向下游提供電子的能力。加硅處理后，相對可變熒光ΔVt的變幅明顯減小，Cd0.05+Si 處理在0.3 ms 處的葉綠素熒光產量與對照相比無明顯變化，Cd0.10+Si 處理在0.3 ms 處的葉綠素熒光產量略高于對照。這說明加硅處理可以緩解鎘脅迫下電子從QA向QB傳遞的抑制作用，有利于維持放氧復合體的穩定性，且Cd0.05+Si 處理的效果好于Cd0.10+Si 處理。

K 相相對可變熒光（Vk）、放氧復合體（OEC）也可以反映PSⅡ供體側的受損程度[21-22]。由表3 可知，與CK 相 比，Cd0.05和Cd0.10處 理 的Vk分 別 增 加11.76%和57.55%，OEC 分別降低5.10%和23.70%，差異均達到顯著水平，表明鎘處理使PSⅡ供體側受到傷害，且隨著鎘濃度的增加，傷害程度提高。這可能是由于錳簇復合體從放氧復合體上裂解出來[17]，導致水裂解系統受抑制，干擾了PSⅡ上放氧復合體的機能發揮[23]。與不加硅處理相比，Cd0.05+Si 處理和Cd0.10+Si 處理的Vk分別降低11.39%和28.74%，OEC 分別提高5.58%和24.77%，差異達顯著水平。這可能是由于硅可以促進植物對Mn 的吸收[19，24]。而Mn作為放氧復合體的組成成分[25]，其含量的提高有利于放氧復合體的結構恢復，降低受損程度，使水裂解反應正常進行，從而減輕了鎘脅迫對煙草葉片PSⅡ供體側的傷害。

2.4 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ受體側的影響

由圖4 可知，鎘脅迫下，煙草葉片PSⅡ受體側受到傷害，電子傳遞發生變化。鎘脅迫下的J 相相對可變熒光（VJ）和QA還原速率（Mo）較CK 分別增加7.09%～31.70%和11.45%～57.30%，受體庫容量（Sm）在Cd0.05處理時變化不明顯，而在Cd0.10處理時明顯降低。煙草葉片電子傳遞到電子傳遞鏈QA-下游的電子的概率（ψo）和用于電子傳遞的量子產額（φEo）分別降低4.46%～19.91%和4.29%～20.19%，說明鎘脅迫下電子傳遞受到抑制。這可能是由于葉綠體是植物產生活性氧的重要部位，在鎘脅迫下導致葉綠體內活性氧含量增加，活性氧會攻擊葉綠素和PSⅡ反應中心的D1蛋白，從而影響光合電子的傳遞，損傷光合機構[22]。鎘脅迫下加硅處理，可以緩解煙草葉片PSⅡ受體側受到傷害。在0.05 mmol·L-1鎘濃度下，各參數與CK 沒有明顯差異，在0.10 mmol·L-1鎘濃度處理下，VJ和Mo得到有效恢復，Sm、ψo和φEo與CK 差異不明顯。這表明硅可以減輕鎘脅迫對PSⅡ受體側的傷害，緩解鎘對煙草葉片電子傳遞的抑制作用。其原因可能是加硅處理提高了酶活性，降低活性氧含量[24，26]，緩解膜脂過氧化程度，減輕活性氧對類囊體膜和PSⅡ反應中心D1蛋白的損傷所致。

表2 硅對鎘脅迫下煙草葉片可變熒光和光化學效率的影響①Tab.2 Effects of silicon on variable fluorescence and photochemical efficiency of tobacco leaves under cadmium stress

圖3 硅對鎘脅迫下煙草葉片相對可變熒光ΔVt的影響Fig.3 Effects of silicon on relative variable fluorescence ΔVt of tobacco leaves under cadmium stress

表3 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ供體側參數的影響Tab.3 Effects of silicon on PSⅡdonor side parameters of tobacco leaves under cadmium stress

2.5 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ反應中心的影響

2.5.1 煙草葉片PSⅡ反應中心數量

如 圖5 所 示，與CK 相比，Cd0.05和Cd0.10處 理 的煙草葉片單位面積PSⅡ有活性的反應中心數量（RC/CSo）分別降低8.76%和23.81%，表明鎘處理使煙草葉片PSⅡ有活性的反應中心數量顯著減少，阻礙了反應中心色素分子對光能的吸收轉化；而加硅處理后，RC/CSo顯著提高，與不加硅處理相比，Cd0.05+Si 和Cd0.10+Si 處理分別提高8.80%和24.35%。這表明施用硅可增加單位面積有活性的PSⅡ反應中心的數量，有利于反應中心色素分子對光能的吸收利用。

2.5.2 煙草葉片單位PSⅡ反應中心能量流參數

由表4 可知，鎘脅迫下，單位反應中心對光能的吸收（ABS/RC）、捕獲（TRo/RC）以及耗散（DIo/RC）增加，與對照相比，Cd0.05處理的ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC 分別上升4.00%、4.13%和3.01%，差異不明顯，而Cd0.10處理的ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC分別上升20.35%、19.31%和25.56%，差異達到顯著水平。單位反應中心用于電子傳遞的能量（ETo/RC）在鎘脅迫下降低，與對照相比，Cd0.05處理降低了0.44%，差異不明顯；Cd0.10處理降低了4.52%，差異達到顯著水平。這種變化趨勢與孟力力等[27]的試驗結果一致，這可能是PSⅡ反應中心發生了可逆失活，形成一個能量陷阱，能夠吸收光能，但不能用于推動電子傳遞[20]。進而也導致單位反應中心用于熱耗散的能量（DIo/RC）增加，說明煙草葉片PSⅡ反應中心的防御機制在鎘脅迫后啟動，以熱能和熒光的形式將葉片中剩余的激發能耗散掉，造成煙草葉片對光能的利用率降低。加硅處理后，ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC 降低，ETo/RC 提高。Cd0.05+Si 處理下的各參數較Cd0.05處理略有提高，差異不明顯；Cd0.10+Si 處理較Cd0.10處理的ABS/RC、TRo/RC 和DIo/RC 分別降低13.78%、12.91%和18.16%，ETo/RC 提高3.33%，差異達到顯著水平。這表明加硅處理可以提高用于電子傳遞的能量，減少因熱耗散而損失的能量。

圖4 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ供體側、受體側參數值相對于對照組數值百分比的影響Fig.4 Percentages of parameter value of PSⅡdonorand acceptor-side in tobacco leaves under cadmium stress comparing to the control

圖5 硅對鎘脅迫下煙草葉片RC/CSo的影響Fig.5 Effects of silicon on RC/CSo of tobacco leaves under cadmium stress

表4 對鎘脅迫下煙草葉片單位PSⅡ反應中心能量流參數的影響Tab.4 Effects of silicon on energy fluxes per PSⅡreaction center of tobacco leaves under cadmium stress

2.6 硅對鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ性能指數的影響

光合性能指數PIabs反映了PSⅡ系統的整體功能，包含了3 個獨立參數：RC/ABS、ψo和φPo，可以更準確地反映植物光合機構的狀態[27-28]。從圖6可知，鎘脅迫下PIabs極顯著降低，與CK 相比，Cd0.05處理的PIabs降低13.48%，Cd0.10處理降低51.65%，表明PSⅡ系統結構和功能受到損害。而加硅處理后，Cd0.05+Si 處理的PIabs較Cd0.05處理增加17.58%，Cd0.10+Si 處理較Cd0.10處理增加76.30%，差異達到顯著水平。這表明加硅處理可提高煙草葉片PSⅡ系統的整體性能，有利于光合作用的進行。

3 結論

在室內（自然光照和溫度）水培試驗條件下，試驗結果表明：①鎘脅迫可導致快速葉綠素熒光誘導動力學曲線發生變化，Fo和最Fm顯著降低，Cd0.10處理出現K 相。Fv/Fm和PIabs降低，光合機構受到破壞；加硅處理后，熒光動力學曲線基本與對照重合，Fv/Fm和PIabs提高，可減輕光合機構受到的破壞。②鎘脅迫下煙草葉片PSⅡ供體側和受體側受到破壞，向下游提供電子的能力減弱，阻礙光合電子傳遞；加硅處理可以緩解煙草葉片PSⅡ供體側和受體側受到破壞，有利于光合電子的傳遞。③鎘脅迫可使單位PSⅡ反應中心數量減少，能量流參數發生變化，使更多的能量用于熱耗散；加硅處理可增加單位PSⅡ反應中心數量，優化能量流參數，使更多的能量用于電子傳遞，緩解鎘對光合機構的傷害，增強煙草對鎘脅迫的抗性。

圖6 硅對鎘脅迫下煙草葉片性能指數（PIabs）的影響Fig.6 Effects of silicon on performance index (PIabs) of tobacco leaves under cadmium stress