氮用量對蛟河曬紅煙碳氮代謝關鍵酶活性及品質的影響

凡 聰，趙 兵 飛，符 云 鵬*，侯 振 武，王 靜，付 全 善

1. 河 南 農 業 大 學 煙 草 學 院 ， 鄭 州 市 金 水 區 文 化 路 95 號 450002

2. 吉 林 省 蛟 河 市 農 業 局 ， 吉 林 省 蛟 河 市 民 主 路 19- 4 號 132500

3. 吉林省蛟河市煙葉有限公司，吉林省蛟河市河南街楊木林子路27 號 132500

碳、氮代謝是煙草最基本的生理代謝過程，其代謝強度、協調程度及在煙葉生長發育過程中的變化動態對煙葉品質形成具有重要影響[1-2]。氮用量對煙草碳、氮代謝強度起重要的調節作用，并影響煙葉的生長發育及品質[2-3]。岳紅賓[4]報道，在一定范圍內，隨著氮素水平的提高，烤煙淀粉酶、硝酸還原酶活性呈上升趨勢；低氮水平下由氮代謝轉化為碳代謝的時間提前，高氮水平下由氮代謝轉向碳代謝的時間推后。魯黎明等[5]研究表明，施氮量對烤煙氮代謝關鍵酶基因表達及氮代謝產物有顯著影響，可通過調整施氮量來調控煙葉含氮化合物含量。邱標仁等[6]發現，在保障煙草正常生長發育和煙葉產質量的基礎上，適當控制氮用量可有效降低煙葉中煙堿含量，提高煙葉（尤其是上部煙葉）可用性。鄭昕等[7]研究表明，四川萬源曬紅煙在留葉數相同的情況下，氮用量由195 kg/hm2增 至255 kg/hm2，調 制 后 煙 葉 總氮、煙堿、硝酸鹽、TSNAs 及鉀含量顯著提高，總糖、還原糖含量顯著降低。邱寶平等[8]報道，吉林農安曬紅煙總糖、還原糖含量隨著氮用量的增加而降低；煙堿、總氮含量隨著氮用量的增加而增加，在中氮水平（67.5 kg/hm2）下煙葉品質較高。施氮量過高時，碳水化合物積累代謝減弱，煙株光合作用產物大部分被用于含氮化合物的合成，導致淀粉積累延遲且積累量少，造成煙葉品質下降[9]。吉林蛟河曬紅煙有“正宗關東煙”之稱，種植面積較大，但長期以來缺乏深入研究，生產上追求高產，氮素營養過剩現象普遍，導致煙株葉片過大，煙葉碳、氮代謝不平衡，煙葉化學成分欠協調，香氣量不足，難以滿足高檔低焦油卷煙配方的要求。為此，進行了氮用量對蛟河曬紅煙碳氮代謝關鍵酶活性及化學成分影響試驗，旨在為蛟河產區曬紅煙的合理施肥及進一步提高煙葉品質和可用性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗于2017—2018 年在吉林省蛟河市漂河鎮新春村進行。該產區地處緩坡丘陵地帶，屬溫帶大陸性季風氣候，無霜期120～130 d，年均氣溫3.4 ℃，年降水量710 mm。試驗地土壤為暗棕壤，地勢平坦，肥力均勻。主要養分含量見表1。

1.2 試驗設計

試驗設置4 個處理，N0、N1、N2 和N3 處理氮用量分別為0（對照，CK）、75.0、97.5 和120.0 kg/hm2。采用隨機區組排列，3 次重復。各處理磷、鉀用量相同，分別為120.0 和360.0 kg/hm2。施氮處理的氮素由煙草專用肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶30）提供，其中N0、N1 和N2 處理的磷、鉀不足部分分別由過磷酸鈣（N∶P2O5∶K2O=0∶12∶0）、硫酸鉀（N∶P2O5∶K2O=0∶0∶50）補充，其中磷肥、70%的煙草專用肥于移栽前穴施，土肥混勻，30%的煙草專用肥及硫酸鉀于移栽后30 d 追施。試驗品種為漂河1號，各處理行、株距分別為1.2 m 和0.5 m，初花期打頂，留葉數均為9 片/株，移栽后90 d 采收。其他栽培調制措施按蛟河市曬紅煙生產技術規范實施。

表1 試驗地土壤主要養分含量Tab.1 Contents of soil main nutrients in experimental fields

1.3 測定指標與方法

1.3.1 碳氮代謝關鍵酶活性及質體色素含量

于移栽后35、60 和85 d 選取各處理代表性煙株中部葉進行測定。硝酸還原酶活性采用活體法測定[10]，谷氨酰胺合成酶活性參照文獻[11]的方法測定，蔗糖轉化酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[12]，葉綠素和類胡蘿卜素含量采用丙酮浸提比色法測定[11]。

1.3.2 常規化學成分

取各處理調制后具有代表性的中部煙葉樣品進行化學成分分析?？偺?、還原糖、淀粉、煙堿、總氮、鉀和氯含量分別按照YC/T 159—2002[13]、YC/T 216—2013[14]、YC/T 160—2002[15]、YC/T 161—2002[16]、YC/T 217—2007[17]、YC/T 162—2011[18]等標準方法測定，測定儀器為德國BRAN+LUEBBE 公司生產的AA3 型流動分析儀。

1.3.3 感官質量評價

樣品制備及評價方法參考文獻[19-20]，由河南中煙工業有限責任公司技術中心7 位具有評吸資質的人員進行評價。

1.4 數據處理

利用Microsoft Excel 2013 進行數據處理與制圖，利用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，LSD 法進行處理間差異的顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同處理對曬紅煙碳氮代謝關鍵酶活性的影響

2.1.1 硝酸還原酶（NR）活性

NR 是植物氮代謝的限速酶，對氮代謝的強弱起著關鍵作用[21]。由圖1 可知，曬紅煙中部葉NR活性隨移栽天數增加呈先增加后降低的趨勢，峰值出現在移栽后60 d。3 個測定時期中，曬紅煙NR 活性均隨施氮量的增加而提高。移栽后35 d和60 d，3 個施氮處理的中部葉NR 酶活性均顯著高于對照，且N3 處理NR 活性顯著高于N1 處理，說明煙株生長前期氮素不足會嚴重影響煙葉的氮代謝，進而影響煙株的生長發育。移栽后85 d 的成熟期煙葉，N2 和N3 處理NR 活性顯著高于對照、N3 處理顯著高于N1 處理。

圖1 不同處理曬紅煙NR 活性比較（2017）Fig.1 NR activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments（2017）

2.1.2 谷氨酰胺合成酶（GS）活性

圖2 表明，移栽后35 d，N3 處理中部煙葉GS 活性顯著高于對照，其他處理之間差異不顯著，可能是該階段煙株較小，對氮素的同化能力較弱，只有高氮處理的氮素同化能力顯著增高。移栽后60 d，各處理GS 活性差異顯著，N2 處理GS 活性最高，對照最低，說明該階段曬紅煙對氮素吸收、同化能力增強，導致了不同氮用量之間GS 活性差異顯著，但過量施用的氮素并不能被煙株同化利用。移栽后85 d，各處理GS 活性均大幅度下降，3 個施氮處理GS 活性差異不顯著，但三者均顯著高于對照。

圖2 不同處理曬紅煙GS 活性比較（2017）Fig.2 GS activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments（2017）

2.1.3 蔗糖轉化酶（INV）活性

圖3 表明，各處理中部煙葉INV 活性隨生育期的推進呈下降的趨勢，特別是移栽60 d 后，INV 活性大幅度下降，這有利于光合產物在葉片中的積累。3 個測定時期煙葉INV 活性均隨氮用量的增加而提高，說明增施氮肥能夠促進蔗糖轉化為單糖，為煙草形態建成提供碳源和能量，進而促進煙株快速生長。移栽后35 d 和60 d，各施氮處理煙葉INV 活性顯著高于對照，N3 處理煙葉INV 活性顯著高于N1 處理；移栽后85 d，N3 處理中部葉INV 活性顯著高于其他處理，可見氮素過量不利于煙葉中碳水化合物的積累。

圖3 不同處理曬紅煙INV 活性比較（2017）Fig.3 INV activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2 不同處理對曬紅煙質體色素及淀粉含量的影響

2.2.1 葉綠素含量

由圖4 可知，隨移栽后天數的增加，N0 和N1處理葉綠素含量呈下降趨勢，可能是由于氮素不足影響了葉綠素的合成；N2 和N3 處理葉綠素含量則表現為先增加后降低的趨勢。3 個測定時期曬紅煙葉綠素含量均隨氮用量的增加而提高，說明增施氮肥促進了葉綠素的合成，特別是在移栽后85 d 煙葉成熟期，N3 處理葉綠素含量顯著高于其他處理，說明氮用量過高延緩了曬紅煙中葉綠素的降解，會導致煙葉貪青晚熟。

圖4 不同處理曬紅煙葉綠素含量比較（2017）Fig.4 Chlorophyll contents in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2.2 類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素在煙葉成熟和調制過程中的降解是形成煙葉香氣前體物質的基礎，對調制后煙葉的香氣有重要影響[22-24]。由圖5 可知，各生育期曬紅煙類胡蘿卜素含量隨氮用量的增加而增加，這與前人在烤煙上的研究結果一致[25-26]，說明增施氮肥不僅能促進葉綠素的合成，而且也能促進類胡蘿卜素的合成。在移栽后35 d，N3 和N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量顯著高于N1 和N0；移栽后60 d時，除N3 和N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量差異不顯著外，其他處理間差異均達到顯著水平；在移栽后85 d 煙葉成熟采收期，除N1 和N2 處理間類胡蘿卜素含量差異不顯著外，其他處理間差異均達到顯著水平。

對照和低氮處理中部葉類胡蘿卜素含量較低，且隨生育期的推進呈下降趨勢；N2 和N3 處理煙葉類胡蘿卜素含量在移栽后35～60 d 時增加，之后隨煙葉的成熟衰老而下降，N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量下降速度最快且顯著低于N3 處理，說明適宜氮用量既能保證大田生長前、中期葉片積累較多的類胡蘿卜素，又能確保有較充足的類胡蘿卜素降解，這對增加煙葉香氣前體物質十分有利。

圖5 不同處理曬紅煙類胡蘿卜素含量比較（2017）Fig.5 Carotenoid contents in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2.3 淀粉含量

由表2 可知，曬紅煙淀粉含量隨生育期的推進呈增加趨勢，移栽后35～60 d，各處理煙葉淀粉含量增加緩慢，且處理間差異不顯著，說明該階段葉片光合產物主要用于煙株的生長及形態建成；移栽后60～85 d，各處理煙葉淀粉含量大幅度增加，且隨氮用量的提高而顯著下降，但處理間差異不顯著，主要與此時煙葉中轉化酶活性高，蔗糖消耗多，光合產物在淀粉合成積累代謝中分配較少有關；至移栽后85 d，煙葉已基本成熟，即將采收，此時煙葉淀粉含量較移栽后60 d 時大幅度增加，且隨氮用量的增加，煙葉淀粉含量顯著下降，這與轉化酶活性的變化相吻合。

表2 不同處理各生育期煙葉淀粉含量比較①（2017 年）Tab.2 Starch contents in dark sun-cured tobacco leaves at different growth stages under different treatments (2017)（%）

2.3 不同處理對調制后煙葉常規化學成分的影響

兩年的試驗結果表明（表3），隨氮用量的增加，曬紅煙總氮及煙堿含量呈增加趨勢，2017 年N3 與N2 處理總氮和煙堿差異不顯著，但二者顯著高于其他處理；2018 年不同處理間總氮含量差異顯著，煙堿含量表現與2017 年相似。曬紅煙總糖和還原糖含量隨氮用量增加呈降低趨勢，2017 年N3 與N2 處理間差異不顯著，2018 年各處理間差異顯著；2018 年曬紅煙糖含量總體低于2017 年，可能與2018 年曬紅煙調制期間雨水較多、濕度較大，煙葉調制時間相對較長、糖消耗較多有關。兩年試驗的施氮處理煙葉鉀含量均顯著高于對照，N1和N2 處理顯著高于N3 處理，說明氮素過高可降低煙葉鉀含量。施氮處理煙葉氯含量顯著高于對照，主要與施氮處理的煙株長勢較強、對氯吸收能力增加有關。而不同氮用量對煙葉氯含量影響較小。

表3 不同處理調制后煙葉常規化學成分比較Tab.3 Routine chemical components in cured leaves under different treatments （%）

2.4 氮用量對曬紅煙感官質量的影響

2018 年試驗與評價結果表明（表4），在0～97.5 kg/hm2范圍內，隨氮用量的增加，煙葉香氣質、香氣量、濃度和勁頭等指標的分值及感官評吸總分提高，氮用量超過97.5 kg/hm2時這些指標分值下降，說明施氮量過高，煙葉感官質量下降。2017 年試驗曬紅煙的香氣質、濃度、勁頭、刺激性、燃燒性等指標的分值及感官評吸總分均以氮用量75.0 kg/hm2時最高，超過此用量則明顯降低。因過高的氮用量導致煙葉采收時葉綠素含量偏高，加之2017 年煙葉調制期間當地氣候相對干燥，煙葉色素降解難度較大，導致N2 和N3 處理的煙葉感官質量明顯下降。

表4 不同處理曬紅煙感官質量比較Tab.4 Sensory quality of dark sun-cured tobacco leaves under different treatments （分）

3 討論

煙葉化學成分含量及其協調程度是決定煙葉內在品質的基礎，煙葉在生長發育過程中碳氮代謝強度、協調程度及其變化動態對其化學成分有重要影響[27]。在諸多營養元素中，氮素是影響煙葉產量、化學成分和感官質量的重要元素之一[28]，氮素主要通過影響煙草的碳、氮代謝強度及其協調程度而影響煙葉產量和品質[27]。NR是煙草氮代謝的最初反應催化者，將硝態氮催化形成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在亞硝酸還原酶（NiR）的催化下形成銨；隨后GS 將谷氨酸和銨催化形成谷氨酰胺，最終銨參與到氨基酸的合成[29]，而氨基酸是合成葉綠素、蛋白質、煙堿等有機含氮化合物的主要原料。本試驗結果表明，曬紅煙NR 和GS 活性在移栽后60 d 最高，之后隨煙葉成熟衰老而下降，這與葛國鋒等[31]的研究結果一致；隨氮用量的增加，曬紅煙中部葉氮代謝的關鍵酶NR 活性、葉綠素含量及調制后煙葉總氮和煙堿含量呈增加趨勢，這與前人研究結果一致[4-9，27，30]。本試驗中移栽后60 d氮用量為120.0 kg/hm2的處理曬紅煙GS 活性顯著低于氮用量為97.5 kg/hm2的處理，這與魯黎明等[5]的研究結果基本一致，可能與過高的氮用量抑制了GS 酶基因的表達有關[5，31]。

在植物生長發育和代謝過程中，轉化酶參與光合作用的調節，主要調節光合作用產物在蔗糖和淀粉之間的分配[32]。當氮用量增加時，氮代謝增強，煙草生長旺盛，對能量和碳源需求較高，光合作用產生的磷酸丙糖在細胞質中形成的蔗糖在INV 的催化下發生不可逆水解形成果糖和葡萄糖，為氮代謝等途徑提供碳源和能源，并參與煙草生長和器官建成[33]，導致淀粉積累代謝減弱。因此，INV 活性與煙株生長速率、煙葉氮代謝強度一致，而與煙葉中碳水化合物如淀粉的積累呈負相關。本研究表明，在移栽后60 d 即曬紅煙旺盛生長期INV 活性最高，而在曬紅煙成熟期INV 的活性大幅度下降，與此同時淀粉含量大幅度增加，并隨氮用量的增加而顯著降低，進而導致調制后煙葉糖含量隨氮用量增加而顯著下降。這些化學成分含量及其比例的變化最終影響煙葉的感官質量。

本試驗中，氮用量在0～97.5 kg/hm2范圍內調制后的曬紅煙鉀含量顯著增加，這可能與氮用量的增加促進了煙株的生長、提高了煙株對鉀素的吸收積累能力有關；當氮用量超過97.5 kg/hm2時，煙葉鉀含量下降，可能與過高的氮用量對鉀素吸收產生了拮抗作用有關。

4 結論

本研究結果表明，吉林蛟河煙區隨施氮量的增加，曬紅煙生長過程中氮代謝關鍵酶NR、GS 活性增加，葉綠素、類胡蘿卜素含量顯著升高；INV活性提高，成熟期淀粉含量顯著降低。隨施氮量的增加，調制后曬紅煙總氮、煙堿含量增加，糖含量下降；煙葉鉀含量以氮用量97.5 kg/hm2最高，總體感官質量以施氮量75.0～97.5 kg/hm2最優。因此，在吉林蛟河煙區肥力較高的暗棕壤上種植曬紅煙，適宜氮用量為75.0～97.5 kg/hm2，生產的煙葉化學成分協調、感官質量較優。