基于聚鄰苯三酚修飾的甲霜靈分子印跡傳感器制備與應(yīng)用

王春瓊，彭麗娟，李籽萱，張 燕，李 苓，陳 丹，曾彥波，李 鄲，劉宇晨，曹秋娥*

1. 云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站, 昆明市高新開發(fā)區(qū)科醫(yī)路41 號 650106

2. 云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明市五華區(qū)翠湖北路2 號 650091

3. 紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司會(huì)澤卷煙廠，云南省曲靖市會(huì)澤縣金鐘鎮(zhèn)東郊 654200

煙草中農(nóng)藥殘留的控制是保證煙草制品吸用安全的重要手段，近年來一直是煙草行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。煙草農(nóng)殘的有效檢測技術(shù)研究不僅對于保障煙葉質(zhì)量和煙草企業(yè)的利益有重要意義，而且對于保障消費(fèi)者健康和生態(tài)環(huán)境安全也非常重要。甲霜靈[1]是一種廣譜、高效、低毒的內(nèi)吸殺菌劑，在煙草上施用非常廣泛。盡管甲霜靈是低毒類農(nóng)藥，但由于其使用量不斷提高、使用范圍不斷擴(kuò)大，其環(huán)境生態(tài)、農(nóng)藥殘留等問題引起了廣泛的關(guān)注，世界各國對植物中甲霜靈殘留量[2]都有明確的規(guī)定。因此研發(fā)出一種對甲霜靈進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高靈敏度定量分析方法顯得尤為重要。目前，甲霜靈的檢測方法主要有液相色譜法（LC）[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[7-12]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[12-13]，但這些方法存在成本高、耗時(shí)長、樣品前處理操作繁瑣等不足[14]。分子印跡傳感器是以基于分子印跡技術(shù)制備的印跡敏感膜為識別元件，能夠?qū)Ｒ蛔R別目標(biāo)分子，具有制備簡單、成本低廉、抗惡劣環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已被用于環(huán)境監(jiān)測、藥物分析和農(nóng)殘檢測等領(lǐng)域[15-16]。目前，采用分子印跡傳感器測定煙草農(nóng)殘甲霜靈的研究鮮見報(bào)道。因此，利用鄰苯三酚中苯環(huán)上羥基對電極信號的放大作用，先在玻碳電極表面修飾一層鄰苯三酚，再以甲霜靈為模板，苯酚為功能單體，在鄰苯三酚修飾玻碳電極表面通過電聚合制備甲霜靈分子印跡膜，以構(gòu)建一種應(yīng)用簡單、測定快速、結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性和靈敏度高的傳感器，為檢測煙草農(nóng)藥殘留甲霜靈提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

4 個(gè)初烤煙葉樣品（2018 年產(chǎn)自云南曲靖、C3F 等級）由云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站提供；空白煙葉基質(zhì)由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

苯霜靈、烯酰嗎啉、甲霜靈、氟嗎啉、樂果和百菌清（標(biāo)準(zhǔn)品，99.99%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；苯酚、鄰氨基酚、鄰苯二胺、鄰苯三酚和間苯二胺（AR，天津光復(fù)化工研究院）；Al2O3拋光粉（0.5 m，50 nm，純度大于99%，浙江理協(xié)儀器設(shè)備有限公司）；去離子水（18.25 MΩ·cm）。

CHI660 型電化學(xué)工作站[采用三電極系統(tǒng)：工作 電 極為 玻 碳 電 極（glassy carbon electrode，GCE）及各種修飾玻碳電極，輔助電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極；上海辰華儀器有限公司]；6470 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國Agilent 公司）；AE-200 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Millipore 超純水儀（德國Merck Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 玻碳電極預(yù)處理

1.2.2 聚鄰苯三酚修飾電極的制備

稱取1.51 mg 鄰苯三酚于10 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，混勻后得到濃度為1.2 mmol/L 的鄰苯三酚溶液；將預(yù)處理好的玻碳電極置于上述溶液中，浸泡10 min，用循環(huán)伏安（cyclicvoltammetry，CV）在-0.4～1.0 V 電位范圍內(nèi)以20 mV/s 速率聚合10 次，使鄰苯三酚聚合膜沉積在玻碳電極表面；將電極用去離子水沖洗表面后，置于0.1 mol/L NaOH中，以100 mV/s 速率在-0.4～1.0 V 電位范圍內(nèi)掃3次CV 以去除電極表面未聚合的鄰苯三酚，得到鄰苯三酚修飾玻碳電極。

1.2.3 甲霜靈印跡傳感器的制備

甲霜靈印跡傳感器的制備過程如圖1 所示。將0.16 mmol 苯酚和0.01 mmol 甲霜靈溶于10 mL硼砂-硼酸緩沖液（pH=9.0）中，通N2（＞99.999%）20 min 除氧，制得預(yù)聚合液；將修飾電極浸于預(yù)聚合液中以50 mV/s 速率在0.3～0.8 V 電位范圍內(nèi)掃40 次CV，使鄰苯三酚修飾玻碳電極表面沉積甲霜靈分子印跡膜；聚合完成后，將印跡電極浸于甲醇/乙酸（體積比3∶1）的洗脫液中，用磁力攪拌洗脫20 min 以去除模板分子甲霜靈。非印跡傳感器除不加模板分子外，其余步驟均同于印跡傳感器。

圖1 甲霜靈印跡傳感器的制備過程示意圖Fig.1 Preparation process of metalaxyl molecular imprinted sensor

1.2.4 電化學(xué)檢測

將三電極系統(tǒng)放入待測溶液[以5.0 mmol/L K3Fe（CN）6為探針，0.1 mol/L KCl 為支持電解質(zhì)]；待背景電流穩(wěn)定，參照文獻(xiàn)[17]的電化學(xué)條件利用CV 和差示脈沖法（differential pulse voltammetry，DPV）表征修飾電極的電化學(xué)性能。其中，CV 測定條件：掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率100 mV/s；DPV 測定條件：掃描范圍和速率同CV，振幅0.05 V，電位增量0.004 V，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.016 s。

裸玻碳電極直接測定；各修飾電極須先在待測液中吸附2 min 后再測定。測定完畢，用洗脫液洗脫20 min，保存于4 ℃冰箱待用。

1.2.5 煙草樣品前處理

①電分析方法前處理。稱取1.0 g 煙末試樣于25 mL 聚乙烯離心管中，加入10 mL 乙腈作為萃取液，超聲提取10 min；過濾后加入3 g NaCl，靜置；分層后取上層乙腈溶液1.5 mL 加入150 mg 無水硫酸鎂和25 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑凈化，過濾后待檢測。

②LC-MS/MS 法前處理。稱取2.0 g 煙末試樣于50 mL 聚乙烯離心管中，加入10 mL 水，振蕩至煙末被充分浸潤；靜置10 min 后加入10 mL 乙腈和100 μL 內(nèi)標(biāo)工作液（20μg/mL 甲霜靈甲苯溶液），2 000 r/min 下渦旋振蕩2 min；置于冰箱冷凍室（-18 ℃）10 min，向聚乙烯管中加入試劑凈化包，2 000 r/min 下渦旋振蕩2 min；4 000 r/min 下離心5 min，取上清液1.5 mL 于2 mL 試劑凈化管，2 000 r/min 下渦旋2 min；4 000 r/min 下離心5 min，收集上清液待測。

1.2.6 農(nóng)藥殘留量的計(jì)算

以干基計(jì)的甲霜靈農(nóng)藥殘留量R，以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）計(jì)算：

式中：R—以干基計(jì)的農(nóng)藥殘留量（mg/kg）；C—由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得到的結(jié)果（μmol/L）；V—萃取液體積（mL）；M—甲霜靈摩爾質(zhì)量（g/mol）；m—樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲霜靈分子印跡膜的表征

圖2 為鄰苯三酚修飾電極在含甲霜靈的苯酚預(yù)聚合液中的電聚合圖。可以看出：甲霜靈的電聚合過程完全不可逆，第1 次CV 掃描在0.7 V 左右出現(xiàn)明顯氧化峰，說明苯酚聚合物在電極表面沉積。隨著CV 掃描次數(shù)的增加，苯酚在電極表面逐漸形成絕緣聚合膜，抑制了電極表面的伏安響應(yīng)，使氧化峰逐漸消失，電流響應(yīng)逐漸減弱，聚合反應(yīng)不再發(fā)生。

2.2 傳感器的分子印跡效應(yīng)

圖2 苯酚電聚合苯酚循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of electropolymerization phenol

由于印跡膜中印跡孔穴可作為電子傳質(zhì)通道，通道中發(fā)生的分子識別行為可改變電活性物質(zhì)的量，使鐵氰化鉀的氧化電流信號發(fā)生變化，因此可通過鐵氰化鉀氧化還原的電流信號研究膜的形態(tài)特征并間接分析被測物濃度[18]。甲霜靈在-0.2～0.6 V 電位范圍內(nèi)不出峰，因此借助鐵氰化鉀來表征各修飾電極，結(jié)果如圖3 所示。曲線a 為裸玻碳電極，當(dāng)電極表面修飾鄰苯三酚膜后，峰電流顯著增大，達(dá)180μA，表明修飾的鄰苯三酚具有較大的比表面積和良好的導(dǎo)電性能（曲線b）。當(dāng)甲霜靈印跡膜沉積到鄰苯三酚電極表面，由于電極表面被一層致密的不導(dǎo)電膜覆蓋，無傳質(zhì)通道，氧化還原峰消失（曲線c）。當(dāng)用洗脫液去除模板分子后，由于膜中印跡孔穴的形成，探針可通過孔穴到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，從而峰電流重新增加（曲線d）。在曲線e 中，峰電流減小的原因是印跡膜再次吸附甲霜靈，使得傳質(zhì)通道被堵塞。而非印跡傳感器由于不存在印跡孔穴，所以洗脫前（曲線f）、后（曲線g）均不存在氧化還原反應(yīng)。

2.3 電化學(xué)傳感器制備條件優(yōu)化

2.3.1 聚合底液組成的影響及優(yōu)化

單體種類及其與模板分子的濃度比對聚合膜性能有較大的影響[19]。本實(shí)驗(yàn)中對聚合底液中模板與單體的濃度比進(jìn)行了優(yōu)化。配制模板/單體摩爾比為1∶8，1∶12，1∶16，1∶20 和1∶24 的聚合底液制備系列傳感器，結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)模板/單體摩爾比為1∶16 時(shí)，傳感器對8×10-6mol/L 甲霜靈有最大的響應(yīng)電流。

2.3.2 電聚合次數(shù)的優(yōu)化

電聚合過程中掃描次數(shù)對傳感器的影響見圖5。可以看出，聚合掃描20、30、40、50 和60 次的傳感器對模板分子響應(yīng)值先增大后減小，當(dāng)掃描40次時(shí)響應(yīng)電流最大。這可能是由于隨著聚合次數(shù)的增加，分子印跡膜逐漸變厚，位于印跡膜內(nèi)部的模板分子不能完全洗脫[20]，從而導(dǎo)致傳感器的靈敏度降低。因此選擇電聚合掃描次數(shù)為40 次。

圖3 印跡傳感器（A）和非印跡傳感器（B）的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of molecularly imprinted sensor（A）and non-imprinted sensor（B）

圖4 模板/單體摩爾比對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.4 Effect of template/monomers ratio on response of sensor

圖5 電聚合掃描次數(shù)對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.5 Effect of polymerization cycles on response of sensor

2.3.3 緩沖液pH 的影響

在苯酚濃度0.016 mol/L 條件下，改變聚合底液硼砂緩沖液的pH（7.1，8.0，8.4 和9.0），制備系列傳感器，并用DPV 法考察傳感器對甲霜靈的響應(yīng)。結(jié)果（圖6）表明，隨著pH 的增大，傳感器的響應(yīng)值增加，當(dāng)pH=9.0 時(shí)，制得的傳感器對8×10-6mol/L 甲霜靈的響應(yīng)電流最大，說明在此條件下，識別位點(diǎn)被占據(jù)較多，分子印跡效果較好。因此，選擇pH=9.0 的硼砂緩沖液作為聚合基底液。

圖6 硼砂緩沖液pH 對傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.6 Effect of borax buffer solution pH on response of sensor

2.3.4 模板洗脫液及時(shí)間的確定

非共價(jià)型分子印跡聚合物模板去除中常用的洗脫劑是甲醇與乙酸的混合液，本實(shí)驗(yàn)中選取不同體積比（2∶1，3∶1，4∶1）的甲醇/乙酸來去除模板分子。結(jié)果表明：體積比為3∶1 的甲醇/乙酸去除模板效果最好；2∶1 的甲醇/乙酸難以洗脫模板；4∶1 的甲醇/乙酸會(huì)導(dǎo)致印跡膜輕微溶脹，導(dǎo)致印跡膜被破壞。因此選擇3∶1 的甲醇/乙酸作為洗脫劑。

將傳感器置于3∶1 的甲醇/乙酸中磁力攪拌洗脫后用水沖洗，再進(jìn)行CV 掃描，結(jié)果表明，隨著攪拌時(shí)間的增加，CV 峰電流不斷升高。這是因?yàn)橛≯E膜中的甲霜靈不斷被溶出，印跡孔穴增多，使到達(dá)電極表面的鐵氰化鉀探針增多。當(dāng)洗脫時(shí)間超過20 min 后，CV 峰電流不再增加，說明印跡膜中的模板被全部去除。因此確定洗脫時(shí)間為20 min。

2.4 吸附時(shí)間的選擇

考察了甲霜靈在印跡膜上的吸附時(shí)間對電極響應(yīng)的影響。將傳感器浸入8×10-6mol/L 甲霜靈待測液中，每隔20 s 用靈敏度較高的差示脈沖法掃描。結(jié)果表明，隨著吸附時(shí)間的延長，電極響應(yīng)值不斷升高，當(dāng)吸附時(shí)間為2 min 時(shí)響應(yīng)值最高，說明印跡膜中甲霜靈印跡孔穴吸附趨于飽和。因此確定吸附時(shí)間為2 min。

2.5 傳感器的性能研究

2.5.1 線性方程和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察印跡電極在鐵氰化鉀緩沖液中對不同濃度甲霜靈的DPV 響應(yīng)曲線。結(jié)果（圖7）表明，鐵氰化鉀峰電流隨甲霜靈濃度的增加而逐漸降低，其峰電流的響應(yīng)值Δip（鐵氰化鉀緩沖液中不含甲霜靈和含有甲霜靈時(shí)的峰電流之差與甲霜靈濃度c 在3.0×10-9～1.8×10-5mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Δip=1.141 6+0.407c（R2= 0.996 8）。計(jì)算20 次空白實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，以3Sb/k 為檢出限（LOD），其中k 為

圖7 甲霜靈印跡傳感器在鐵氰化鉀緩沖液中對不同濃度甲霜靈的響應(yīng)Fig.7 Response of metalaxyl imprinted sensor to metalaxyl at different concentrations in potassium ferricyanide buffer solution

工作曲線的斜率，則甲霜靈的檢出限為1.01×10-9mol/L，經(jīng)1.2.6 節(jié)公式（1）換算后為0.003 mg/kg。

采用相同的聚合方法在裸玻碳表面制備了甲霜靈印跡膜電極，并研究了此電極測定甲霜靈的線性范圍和檢出限。響應(yīng)電流Δi 與甲霜靈的 濃 度c 在6.0×10-8～3.8×10-6mol/L 范 圍 內(nèi) 具 有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Δi=1.4+0.349c（R2=0.994 7），檢出限為3.1×10-8mol/L（0.086 mg/kg）。綜上可知，鄰苯三酚的引入顯著增加了傳感器的靈敏度。

2.5.2 傳感器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性分子印跡膜對模板分子的選擇性識別是印跡傳感器的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)，這對于基質(zhì)成分很復(fù)雜的煙草樣品來說有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在鐵氰化鉀緩沖液中測定了傳感器對8.0×10-6mol/L甲霜靈的DPV 響應(yīng)，以及含有可能會(huì)對煙草中甲霜靈測定產(chǎn)生影響的烯酰嗎啉、氟嗎啉、苯霜靈，空白煙草提取液、樂果和百菌清時(shí)的DPV 響應(yīng)。由圖8 可知，空白煙草提取液對測定有一定的干擾，但由于電流響應(yīng)值超出該方法線性范圍，因此可忽略不計(jì)。另外，10 倍濃度于甲霜靈的烯酰嗎啉、氟嗎啉和苯霜靈，50 倍濃度于甲霜靈的樂果和百菌清并未干擾甲霜靈的測定結(jié)果，說明印跡孔穴對甲霜靈的選擇性較好。

圖8 干擾物質(zhì)對甲霜靈測定的影響Fig.8 Effect of interference material on determination of metalaxyl

用相同方法制備的5 支電極對相同濃度的甲霜靈進(jìn)行測定，則相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.12%；

2.6 實(shí)際樣品分析

將4 個(gè)煙草樣品用該實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行甲霜靈的檢測，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表1）表明，電化學(xué)分析法測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.98%～4.26%，加標(biāo)回收率為98.5%～113.7%，初步說明測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

為進(jìn)一步驗(yàn)證此傳感器的測定結(jié)果，采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法LC-MS/MS 法測定4 個(gè)煙草樣品中的甲霜靈，結(jié)果見表2。通過T 檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)，P值＞0.05，說明在95%置信度下，兩種方法測定結(jié)果無顯著性差異。可見，本方法與LC-MS/MS 法的一致性較好。

表1 煙草樣品中甲霜靈的測定結(jié)果（n=5）Tab.1 Determination results of metalaxyl in tobacco samples（n=5）

表2 本方法與液相串聯(lián)質(zhì)譜法的比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of comparison experiment between this method and LC-MS/MS（n=5） (mg·kg-1)

3 結(jié)論

以甲霜靈為模板，苯酚為功能單體，在聚鄰苯三酚修飾的玻碳電極表面成功制備了一種能簡單快速靈敏準(zhǔn)確檢測煙草農(nóng)殘甲霜靈的分子印跡傳感器。本方法克服了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中儀器昂貴、分析時(shí)間長、樣品前處理較為繁瑣等不足，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。方法的檢出限為0.003 mg/kg，加標(biāo)回收率為98.5%～113.7%，RSD 為2.98%～4.26%。本方法應(yīng)用簡單、測定快速、結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于煙草農(nóng)殘甲霜靈的檢測。