凍存器官和甲醛固定石蠟包埋組織中RNA的定量表達

呂葉輝 ，黎世瑩 ，李志宏 ，陶瑞旸 ，3，邵煜 ，胡茜 ，楊智昉 ，陳憶九 ，3

（1.上海健康醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，上海 201318；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063；3.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川 成都 610065）

隨著生物醫(yī)學的不斷發(fā)展及學科融合，核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）這一生物大分子在死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷、死亡原因分析、不同體液鑒定等方面的相關研究日益深入，已成為法醫(yī)學研究焦點之一[1-3]。與信使RNA（messenger RNA，mRNA）相比，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）不編碼蛋白質(zhì)，如微小RNA（microRNA，miRNA），其長度只有18～24 nt，在生物體內(nèi)廣泛存在，表達具有組織特異性和高度穩(wěn)定性，是法醫(yī)學研究理想的分子標志物[4-5]。

與凍存組織相比，甲醛固定石蠟包埋（formaldehyde-fixed and paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）組織能保存多年，是法醫(yī)病理學實踐和回顧性研究中最常使用的樣本。隨著RNA提取技術的進步，已有研究[6-8]證實在FFPE樣本中可提取到一定質(zhì)量的RNA，并用于下游定量分析。但是，現(xiàn)有研究的FFPE樣本主要集中在醫(yī)院手術取材病理組織，缺乏法醫(yī)學尸檢來源FFPE樣本中RNA提取及定量研究的相關報道。因此，本研究以不同PMI的人體組織為研究材料，定量檢測管家基因mRNA、miRNA等多種RNA在同一組織凍存樣本及FFPE樣本中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

9700型PCR儀、7500型實時熒光定量PCR儀（美國AB公司），NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），2100生物分析儀（美國Agilent公司）。

RNAlater保護液（日本TaKaRa公司），TRIzolTMPlus RNA Purification試劑盒（美國Invitrogen公司），RNeasy FFPE試劑盒、miScriptⅡ RT試劑盒、Quanti-Nova SYBR Green PCR試劑盒（德國Qiagen公司），焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水。

1.2 樣本收集及總RNA提取

選取4例上海市公安局物證鑒定中心的檢案案例，每例均有詳細的卷宗記錄，編號為1、2、3和4，PMI分別為6h、17h、45h及70h。死者尸體解剖前未經(jīng)凍融過程，解剖時取腦組織（左額葉皮質(zhì)）、心肌組織（心尖）及肝組織（左葉），一部分保存在RNAlater保護液中后置于-80℃凍存?zhèn)溆茫硪徊糠诌M行常規(guī)10%甲醛固定（固定時間為20h）、石蠟包埋處理后常規(guī)保存?zhèn)溆?。本研究方案及樣本取材通過倫理委員會審查，并均獲得家屬知情同意。對于凍存樣本，精確稱取50g組織按照試劑盒說明書提取總RNA并去除基因組DNA（genomic DNA，gDNA）；對于FFPE樣本，保存1年后進行6 μm連續(xù)厚切片，每5片放入DEPC水滅菌的微量離心管后，使用RNeasy FFPE試劑盒提取總RNA并去除gDNA。使用NanoDrop 2000分光光度計測定RNA質(zhì)量濃度及純度，分別用ng/μL及260nm和280nm波長下的光密度比值（D260/D280）表示。使用2100生物分析儀測定RNA完整性，用RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）表示，10為RNA完整性最好，0為最差。

1.3 指標選擇

本研究選擇4種ncRNA作為指標，分別為腦組織特異性微小RNA-125b（microRNA-125b，miR-125b）、心肌組織特異性微小RNA-1（miR-1）、肝組織特異性微小RNA-122（miR-122）及5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）。上述指標的下游引物為通用特異性引物（miScript primer），上游引物（5′→3′）分別為：miR-125b，TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA；miR-1，TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT；miR-122，TGGAG TGTGACAATGGTGTTTG；5S rRNA，TCTCGTCTGAT CTCGGAAGC。此外，選擇管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及β-肌動蛋白（β-actin，ACTB），并根據(jù)文獻[9-10]或設計不同產(chǎn)物長度的引物（較長的用“-L”標識，較短的用“-S”標識），具體如下：GAPDH前引物為共用的CCACATCGCTCAGACACCAT，GAPDHL（323 bp）后 引 物 為 AAGACGCCAGTGGACTCCA，GAPDH-S（71bp）后引物為ACCAGGCGCCCAATACG；ACTB前引物為共用的GCATGGGTCAGAAGGATTCC，ACTB-L（276 bp）后引物為 TGGATAGCAACGTACA TGGC，ACTB-S（58 bp）后引物為 AGGATGCCTCTCT TGCTCTG。

1.4 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應與標準曲線制備

實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照說明書，使用miScriptⅡ RT試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription，RT），合成的互補DNA（complementary DNA，cDNA）置于-20℃?zhèn)溆茫皇褂肣uantiNova SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR，按照試劑盒說明書配制20μL反應體系，并應用7500型實時熒光定量PCR儀進行擴增。每個樣本重復3次，結(jié)果由系統(tǒng)自動生成，從而得到各RNA指標的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。

標準曲線制備：分別將4例凍存或FFPE混合樣本的cDNA進行10倍連續(xù)梯度稀釋后作為制備標準曲線的cDNA模板，進行上述qPCR反應并繪制標準曲線。標準曲線的主要參數(shù)包括斜率（k）、截距（b）及決定系數(shù)（R2），并通過公式E=（10-1/k-1）×100%計算樣本的擴增效率（E）。

1.5 統(tǒng)計學分析

運用RefFinder工具[11]對各指標的Ct值進行統(tǒng)計學處理，篩選內(nèi)參指標，并對其他RNA指標進行內(nèi)參標準化處理（ΔCt=Ct指標-Ct內(nèi)參）后，運用2-ΔΔCt法分析各指標的表達情況，使用SPSS 22.0軟件對D260/D280、RIN及擴增效率進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗和Pearson相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 RNA質(zhì)量濃度、純度和完整性

兩種樣本提取所得的總RNA均經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計測量質(zhì)量濃度和純度，結(jié)果如下。在凍存樣本中，腦組織所提取的RNA質(zhì)量濃度為608ng/μL，心肌組織為 449 ng/μL，肝組織為 839 ng/μL，均高于FFPE樣本所提取的RNA質(zhì)量濃度［208 ng/μL（腦組織）、132ng/μL（心肌組織）及342ng/μL（肝組織），P＜0.05］。大部分樣本RNA的D260/D280值在1.7～2.0，兩種樣本間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明所提取的RNA純度均較高。

每例樣本均檢測其RIN，結(jié)果如圖1所示。各組織凍存樣本的RIN值與PMI（6h、17h、45h及70h）有關，隨著PMI延長逐漸降低。各組織凍存樣本的RIN值均明顯高于同一組織FFPE樣本的RIN值，表明經(jīng)甲醛固定石蠟包埋處理后，RNA的完整性顯著下降。

圖1 案例1～4中各組織樣本的RIN

2.2 RT-qPCR及擴增效率

在所有組織凍存樣本中，對各RNA指標均進行RT-qPCR擴增并獲得Ct值，觀測其擴增曲線及溶解曲線，擴增曲線為標準“S”形曲線，溶解曲線呈單峰，且多樣本重合度高，表明各樣本RNA指標均成功特異性擴增。在FFPE樣本中，總RNA亦均成功反轉(zhuǎn)錄并進行RT-qPCR定量，除GAPDH-L和ACTB-L在部分FFPE樣本（3號案例的肝組織及4號案例的3種組織）中Ct值超過檢測閾值，其余RNA指標均成功特異性擴增。

擴增效率計算使用標準曲線法，以凍存腦組織miR-125b為例，標準曲線如圖2所示，k=-3.349，即miR-125b的擴增效率為98.9%。各RNA指標在不同樣本中的平均擴增效率如圖3所示。在凍存樣本中，各指標的擴增效率都接近理想擴增效率（90%～110%）。在FFPE樣本中，組織特異性miRNA和5S rRNA的擴增效率較高，與凍存樣本類似；而管家基因mRNA的擴增效率與產(chǎn)物長度有關，GAPDH-S和ACTB-S的擴增效率較為理想，但GAPDH-L和ACTB-L擴增效率較差。

圖2 凍存腦組織miR-125b的標準曲線

圖3 各指標的擴增效率

2.3 內(nèi)參指標篩選

在各組織樣本中選取理想擴增效率的RNA指標作為候選內(nèi)參指標，分別為：miR-125b、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（腦組織）；miR-1、5S rRNA、GAPDH-S及 ACTB-S（心肌組織）；miR-122、5S rRNA、GAPDH-S及ACTB-S（肝組織）。運用Ref-Finder軟件對上述指標的Ct值進行統(tǒng)計學分析，得到各指標的綜合穩(wěn)定度排序為：腦組織中，ACTB-S＞5S rRNA＞miR-125b＞GAPDH-S；心肌組織中，5S rRNA＞ACTB-S＞miR-1＞GAPDH-S；肝組織中，5S rRNA＞miR-122＞GAPDH-S＞ACTB-S。其中，5S rRNA在各組織中穩(wěn)定性都相對較高，故選為本研究內(nèi)參指標。

2.4 定量表達情況分析

對各RNA指標Ct值進行內(nèi)參標準化處理（ΔCt=Ct指標-Ct5SrRNA），并以1號凍存樣本（PMI為6 h）為對照，運用2-ΔΔCt法計算各指標在凍存樣本和FFPE樣本中的相對表達量。以腦組織ACTB-S為例，其在不同樣本中的相對表達量如圖4所示，結(jié)果表明，同一組織凍存樣本和FFPE樣本中ACTB-S的相對表達量高度相關（r=0.945，P＜0.05），證實其在FFPE樣本中能有效擴增，且其平均相對表達量（0.721±0.239）與凍存樣本（0.795±0.232）相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 ACTB-S在腦組織凍存和FFPE樣本中的表達情況

相應的，各RNA指標在各組織凍存和FFPE樣本中的平均相對表達量如圖5所示。

在各組織凍存樣本中（特別是肝組織），GAPDHL和ACTB-L的相對表達量均略低于其對應的短擴增產(chǎn)物的GAPDH-S和ACTB-S，進一步證實隨PMI延長RNA降解增加、完整性下降。在FFPE樣本中，GAPDH-L和ACTB-L的相對表達量較凍存樣本顯著下降，表明經(jīng)FFPE處理后RNA降解明顯；但是擴增產(chǎn)物較短的GAPDH-S、ACTB-S及各組織特異性miRNA（miR-125b、miR-1和miR-122）的表達情況與凍存樣本相比下降不明顯。

圖5 各RNA指標在凍存和FFPE樣本中的相對表達量

3 討 論

FFPE組織樣本是法醫(yī)病理學研究和實踐中重要的材料來源，具有來源充足、可長期保存、疾病類型較多、病理信息豐富等優(yōu)勢。近年來，RNA（特別是小分子miRNA）在死亡原因分析、PMI推斷及損傷時間推斷等方面的作用也受到法醫(yī)學者的重視，因此，如能在FFPE樣本中提取到高質(zhì)量的RNA，并準確定量及獲取相關基因表達信息，對于上述研究具有重要的科研價值。近年來，隨著RNA提取技術的進步和商業(yè)化試劑盒的更新，已有研究[12]證實在FFPE樣本中可有效提取RNA，并能通過RT-qPCR技術檢測各類RNA的表達情況，甚至還可進行高通量分析。此外，法醫(yī)學尸檢組織均經(jīng)過一定的PMI，而PMI對新鮮（凍存）組織及其對應FFPE樣本的影響也值得探究。已有研究[8，13]證實，F(xiàn)FPE樣本中RNA的質(zhì)量與甲醛固定時間和樣本保存時間有關，因此，為了對比不同PMI的凍存及同一組織FFPE樣本中RNA的質(zhì)量，并分析管家基因mRNA及ncRNA的定量表達情況，本研究中各樣本固定時間與保存時間均是一致的。

提取所得總RNA的質(zhì)量檢測一般分為濃度、純度與完整性3項。與前期多數(shù)研究[14-15]一致，在FFPE樣本中提取所得到的RNA濃度低于對應凍存樣本，但可滿足后續(xù)實驗用量。純度分析結(jié)果表明，從所有樣本中提取得到的RNA純度均較高，可用于下游反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR實驗。完整性分析采用RIN表示，在凍存樣本中，RIN值隨PMI延長而下降，證實RNA隨PMI延長會發(fā)生不同程度的降解，導致完整性下降。此外，同一案例中，心肌、腦組織的RIN值均高于肝組織，表明肝組織中RNA較易降解，與前期研究[16]結(jié)果一致。與凍存樣本相比，F(xiàn)FPE樣本RNA的完整性相對較低，表明RNA均發(fā)生不同程度降解導致完整性下降，分析與甲醛引起RNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)及化學修飾有關[17-18]。因此，運用RT-qPCR對FFPE樣本中各RNA指標進行定量分析時，一定要按照標準的流程進行。

本研究RT-qPCR實驗嚴格按照MIQE指南[19]（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）進行，包括標準化的RNA提取、gDNA去除、選取同樣量的RNA進行反轉(zhuǎn)錄、標準曲線和溶解曲線檢驗引物特異性、定量PCR反應3次重復、建立標準曲線計算擴增效率及篩選內(nèi)參指標等，確保定量結(jié)果的準確性和可重復性。為了更好地分析mRNA和ncRNA在FFPE樣本中的表達情況，除常用管家基因GAPDH和ACTB外，本研究還選擇了3種分別在腦、心肌及肝組織中特異性表達的miRNA及常用的內(nèi)參指標5S rRNA，上述指標均具有一定的代表性。此外，本研究還對管家基因mRNA指標設計了不同擴增片段的引物，以進一步探究各組織樣本中RNA的降解程度及產(chǎn)物長度對定量結(jié)果的影響。

RT-qPCR結(jié)果表明，除GAPDH-L和ACTB-L在PMI較長（45h及70h）的FFPE樣本中未檢出外，其余RNA指標均成功擴增并獲得Ct值，但是不同RNA指標的擴增效率在凍存樣本和FFPE樣本中有差異。凍存樣本中各RNA指標的擴增效率都較為理想，而FFPE樣本中GAPDH-L和ACTB-L的擴增效率較差，這一方面與PCR受到抑制有關[15，20]，另一方面也表明FFPE樣本中RNA發(fā)生了不同程度的碎片化，片段較小的miRNA及產(chǎn)物長度較短的mRNA指標可有效擴增[9，21]。

RT-qPCR定量分析結(jié)果的可靠性與內(nèi)參指標密切相關，為了篩選出在所有樣本均能穩(wěn)定表達的內(nèi)參指標，本研究運用能綜合分析的RefFinder工具進行篩選，結(jié)果表明5S rRNA在所有樣本中綜合穩(wěn)定度最高，其表達水平也與各因素無關，是理想的內(nèi)參指標。之后，對各候選RNA指標進行內(nèi)參標準化處理，以準確定量各指標在凍存樣本和FFPE樣本中的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，各指標表達情況與其擴增效率有一致性，擴增效率接近理想的RNA指標，其定量結(jié)果在兩組樣本中也高度相關（如腦組織的ACTB-S，r=0.945）。與國內(nèi)外研究結(jié)果[14-15，22]一致，擴增產(chǎn)物較長的管家基因GAPDH-L和ACTB-L在FFPE樣本中的表達量顯著降低，表明FFPE樣本中長鏈線性RNA的碎片化是不可避免的；而擴增產(chǎn)物較短的mRNA指標（GAPDH-S和ACTB-S）及小分子miRNA，相對不受PMI及FFPE處理的影響，在兩組樣本中表達具有一致性。

綜上所述，盡管FFPE組織樣本中的RNA會發(fā)生不同程度的降解和碎片化，但通過標準化的RT-qPCR、選取合適的RNA指標及設計合適產(chǎn)物長度的引物，可有效地在組織樣本中對管家基因RNA和miRNA進行準確定量，并能在一定程度上反映相關基因的真實表達水平。在后續(xù)研究中，本課題組將進一步擴大樣本量及擴充指標選擇范圍，并探討不同固定時間及保存條件下FFPE樣本中RNA的質(zhì)量及定量表達水平。