嫁接西瓜在不同營養脅迫下最適內參miRNA的鑒定

胡仲遠 陳淑娜 吳維芳 張明方

目的與意義： miRNA在調控植物生物與非生物抗性中具有重要作用，而嫁接是提高西瓜對逆境抗性的重要技術措施。在嫁接誘導的西瓜營養脅迫響應能力改變過程中的功能有待研究揭示。基因表達分析是探究在miRNA介導的分子調控機制的一種重要的手段，選取合適的內參基因來排除誤差是取得可靠的表達結果的前提。由于分子結構和表達特征的相似性，miRNA或者其它小分子RNA比較適合作為miRNA表達分析的內參。因此，本研究旨在篩選出在正常養分條件和氮，磷營養脅迫下，以及在嫁接西瓜接穗和砧木（南瓜，葫蘆）中進行miRNA定量分析的內參基因，為研究miRNAs在嫁接西瓜中調控養分脅迫響應中的功能奠定基礎。

材料與方法： 以西瓜‘早佳為接穗，以葫蘆‘甬砧1號和南瓜‘非常輔佐為砧木。西瓜嫁接、自嫁和實生苗培養在 Hoagland營養液（7.5 mmol·L-1 氮和0.3 mmol·L-1 磷， pH=6）中，煉苗5 d后，分別進行低磷（0.01 mmol·L-1）和低氮 （0.75 mmol·L-1）處理。脅迫5 d后取相應的葉片和根系樣品用于miRNA表達分析。本研究共選取了17個候選內參基因，包括：選自嫁接西瓜苗的小RNA測序中發現的嫁接前后穩定表達的7個miRNAs （miR81，miR82，miRl66b，miRl70，miR3511-3p，miR319b，miR398b 和 miRl66u），其他物種中已經報道的內參miRNA的葫蘆科同源miRNAs（miRl69n-5p，miRl67， miRl67c，miRl67b 和 miRl60a）和2個編碼蛋白質的內參基因YLS8和PP2A以及常用的非編碼RNA（U6和18S）。數據分析主要通過：1）使用軟件StepOne v2.3計算每條引物的擴增效率（E）和相關系數（R2）。2）使用軟件geNorm和NormFinder分析每個內參基因的穩定性。3）使用從嫁接西瓜的小RNA數據庫中挑選出一個響應營養協迫的miR85 驗證待選內參的可靠性。

結果與分析： （1）miRNA表達分析中的一些miRNAs（miR167c，miR167f和miR166b）的穩定性通常都高于蛋白質編碼基因（YLS8和PP2A），說明它們更適合嫁接和養分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內參。（2）沒有單一內參可以在不同物種和不同養分情況下都保持穩定性。miR167c或miR166b是在正常養分條件下接穗和砧木中最穩定的內參。miR167c和miR167f是在低氮或低磷脅迫下的西瓜和南瓜樣品中最穩定的內參，而miR166b是營養脅迫下的葫蘆樣品中最穩定的內參。（3）miR85的矯正結果表明使用最優的內參基因和最優的內參組合矯正得到的定量結果與使用最差的內參得到的結果差異顯著。通過將不同內參矯正結果與高通量測序數據比對，發現miR166b和miR167c可分別作為正常養分條件下的嫁接西瓜接穗和砧木中合適的內參基因。（4）在嫁接西瓜中的多物種共生特性使用單個內參通常會使定量結果發生一定程度的變化，建議使用最優內參組合矯正表達分析結果。

結? ? 論： miRNA更適合作為嫁接和養分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內參。miR167c，miR167f和miR166b適合作為嫁接西瓜及養分脅迫下做矯正miRNA表達分析的內參基因。