玉米TRV-VIGS的優化與頂腐病抗病基因的鑒定

李聰聰 安曉暉 張中起 劉 康 孫 敬

(南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

玉米(Zeamays)是重要的糧食作物和飼料作物，也是重要的模式植物[1-3]。玉米基因組序列測序的完成以及玉米嵌套關聯作圖群體的開發[4]，為玉米功能基因的研究和發掘利用奠定了基礎。

病毒介導的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是一種轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。VIGS技術通過沉默目標基因，使植物產生沉默表型，從而判斷目標基因的功能，無需遺傳轉化或創建突變體，具有快速、高效、高度特異性等優點，適用于植物的高通量功能基因組學研究[5-6]。目前已經發現30多種適用于雙子葉植物的VIGS載體，而適用于單子葉植物的VIGS載體較少[7-8]。其中成功應用于玉米的VIGS載體僅有雀麥花葉病毒(Bromemosaicvirus，BMV)[9]、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)[10]、狐尾草花葉病毒(Foxtailmosaicvirus，FoMV)[11-12]和煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)[13]等。采用BMV、CMV和FoMV病毒沉默載體時，通常需要采用體外轉錄合成RNA直接接種玉米，或者先接種煙草或其他中介宿主植物，從中提取組裝好的病毒再接種玉米。一般需要采用摩擦接種法。但體外轉錄RNA產量低、成本高、易降解，摩擦接種程度不容易掌握，摩擦過度易損傷葉片，摩擦不夠不易接種成功。有研究者采用摩擦接種法沉默八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)基因，發現其只能引起玉米葉片局部條紋化、白化[9-12]。Zhang等[13]利用TRV載體，通過真空輔助農桿菌滲入及共培養的方法，無需RNA操作和接種，沉默PDS基因可使植株玉米整株白化，沉默效果更好、持續時間更長。然而，目前關于TRV-VIGS的沉默效率能否滿足大規模功能基因篩選的需求，影響玉米TRV-VIGS沉默效率的因素，以及如何優化等方面的研究尚鮮見道。MAC(MOS4-associated complex)是以MAC3/PRP19為核心形成的一種蛋白質復合體，對植物免疫和抗病反應起重要調控作用[14-16]，但在單子葉植物中的作用尚未見報道。

本研究利用TRV病毒載體，以玉米PDS基因為標記基因，分別從農桿菌菌株、玉米受體基因型、種子處理方法、真空滲入方法等因素進行優化。在此基礎上，研究VIGS沉默MAC3的效率，接種亞粘團鐮孢菌(Fusariumsubglutinans)，分析沉默MAC3對玉米頂腐病抗性的影響[17]，以期為TRV-VIGS體系應用于玉米基因功能鑒定、玉米頂腐病抗病基因篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米品種鄭單958種子由江蘇省農業科學院提供，從中擴增PDS目的基因片段；先玉335種子由甘肅省張掖市現代農業示范基地提供，從中擴增MAC3目的基因片段；pTRV1、pTRV2載體、大腸桿菌DH5α及農桿菌GV3101、LB4404菌系均為南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室保存；限制性內切酶、rTaq、反轉錄酶均購自上海皓嘉科技有限公司；InvitrogenTMTRIzolTM購自美國ThermoFisher公司；半胱氨酸(Cys)購自南京偉沃生物科技公司；卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮(actosyringone, AS)等均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米PDS和MAC3基因片段的克隆及VIGS載體構建 按照Invitrogen Trizol 試劑盒說明書提取玉米葉片RNA，反轉合成cDNA第一鏈。根據NCBI中公布的玉米PDS基因序列(GRMZM2G410515)和MAC3基因序列(GRMZM2G037698)，參照文獻[18]選擇PDS的VIGS干擾靶標片段，利用在線網站(http://vigs.solgenomics.net/，參數設置為n-mer size：21；Fragment length：500；mismatches：0；Database：ZeamaysB73 v5a)設計MAC3的VIGS干擾靶標片段，分別在上下游引入XbaⅠ和BamHI酶切位點及保護堿基設計引物(ZmPDS-XbaI-F：5′-GCTCTAGACTAGCCAAGTTATTTCCTGA-3′，ZmPDS-BamHI-R：5′-CGGGATCCGGGACGGGAACTTCTCCTGA-3′；ZmMAC3-XbaI-F：5′-GCTCTAGAGCCGGTCAATACCAACAAGGTCGTGAA-3′，ZmMAC3-BamHI-R：5′-CGGGATCCCGCTTATGAAGGGGATGGCTGGAGATT-3′)。以玉米cDNA第一鏈為模板，PCR擴增ZmPDS和ZmMAC3基因片段。DNA凝膠回收試劑盒(南京諾百欣公司)回收純化PCR產物，將目的基因片段克隆到pMD19-T載體并轉化大腸桿菌。測序驗證后再分別插入載體pTRV2中，獲得重組VIGS載體pTRV2-ZmPDS和pTRV2-ZmMAC3，測序驗證正確后保存備用。

1.2.2 農桿菌菌液的制備 將質粒pTRV1、pTRV2-ZmPDS、pTRV2-ZmMAC3分別轉化農桿菌感受態細胞。分別挑取陽性農桿菌單菌落，接種至2 mL含有50 mg·mL-1卡那霉素(Kan)和50 mg·mL-1利福平(Rif)的YEB液體培養基中，28℃、220 r·min-1振蕩培養12 h，菌液PCR檢測正確后，再將菌液以1∶100的體積比轉接至50 mL含50 mg·mL-1Kan和50 mg·mL-1Rif的YEB液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600=0.4左右，將各菌液的OD600值調整至一致。

將上述含pTRV1的農桿菌分別與含有pTRV2-ZmPDS、pTRV2-ZmMAC3的農桿菌菌液以1∶1體積比混合，在所得混合菌液中加入AS(19.62 mg·L-1)、Cys(400 mg·L-1)和Tween 20(5 mL·L-1)，搖晃混勻后得到VIGS轉化菌液備用[13]。

1.2.3 農桿菌真空滲入及共培養VIGS Zhang等[13]報道真空輔助農桿菌滲入TRV-VIGS方法包括真空滲入、種子-農桿菌共培養兩個主要步驟。本研究在此基礎上增加浸種環節，并對真空滲入時間、種子-農桿菌共培養時間等進行優化。具體方法如下：玉米種子用70%酒精浸泡1 min、2.5%次氯酸鈉浸泡10 min、無菌水沖洗5次進行消毒。以不浸種為對照，分別設置加無菌水和VIGS轉化菌液28℃浸種24 h 2個浸種處理；用手術刀片將上述處理的種子種皮劃破放入組培瓶中，再加入40 mL VIGS轉化菌液，使種子完全浸泡其中，真空輔助滲入20、40、60 min 3種處理；種子-農桿菌共培養時間設為10 h和15 h 2個處理(28℃，150 r·min-1)。以上處理所用農桿菌為GV3101、LB4 404 2種菌株。最后用無菌水將玉米種子沖洗干凈，播于營養土中，溫室(溫度25℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗)生長14 d后觀察植株表型并對靶標基因的轉錄水平進行檢測。以無菌水代替上述VIGS轉化菌液為空白對照。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測 提取玉米葉片RNA，利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ kit 反轉錄合成cDNA作為RT-PCR分析的模板。以玉米Actin(J01238，引物Actin-F：5′-CAATGGCACTGGAATGGT-3′；Actin-R：5′-ATCTTCAGGCGAAACACG-3′)作為內參基因，對不同樣品模板進行均一化處理。然后利用ZmPDS基因特異引物(ZmPDS-RT-F：5′-AGGTCGTGGTTGCTGGTGC-3′；ZmPDS-RT-R：5′-ATTCTCCTGGCTTGTTTGG-3′)和ZmMAC3基因特異引物(ZmMAC3-RT-F：5′-AGAAGGAAAGAGATGAGG-3′；ZmMAC3-RT-R：5′-TGAGTGACCAGTAAGCGT-3′)，對不同處理樣品中的ZmPDS和ZmMAC3基因轉錄水平進行半定量RT-PCR分析。PCR反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共28個循環；72℃終延伸10 min，4℃保存備用。

1.2.5 亞粘團鐮孢菌接種及玉米頂腐病菌抗性鑒定 將亞粘團鐮孢菌接種至固體馬鈴薯培養基，28℃培養至長滿培養基后轉移至液體馬鈴薯培養基中，振蕩培養5～7 d，紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液，用無菌水將孢子懸浮液濃度調節至1×107cfu·mL-1[19]。

將采用真空輔助VIGS農桿菌液處理的玉米種子播種，待其生長至第一片真葉即將展開時，將亞粘團鐮孢菌孢子懸浮液浸泡玉米根部10 min，溫室中繼續生長7 d后，參照孟有儒等[19]的方法進行玉米頂腐病表型鑒定。以pTRV1/pTRV2-ZmPDS為VIGS陽性對照，pTRV1/pTRV2:00為ZmMAC3基因的VIGS陰性對照，分析pTRV1/pTRV2-ZmMAC3對玉米頂腐病抗性的影響。

2 結果與分析

2.1 玉米PDS、MAC3基因VIGS沉默載體的構建

提取玉米幼苗的葉片RNA，以反轉錄合成的cDNA為模板，分別獲得大小為315 bp的ZmPDS目的片段和500 bp的ZmMAC3目的片段。克隆測序后，BLAST核酸序列比對結果與玉米B73 GRMZM2G410515和GRMZM2G037698的相似度分別為99%和100%，VIGS靶標基因序列同源性大于85%即可引起有效的基因沉默[20-21]，因此，ZmPDS和ZmMAC3可應用于VIGS試驗。將測序驗證正確的VIGS靶標片段插入pTRV2載體中，經XbaⅠ與BamHI 雙酶切驗證后，分別轉化農桿菌GV3101和LB4404感受態細胞，經菌液PCR驗證后，保存備用(圖1、圖2)。

注：M：2 000 bp marker；1：ZmPDS靶標基因片段擴增；2：pTRV2-ZmPDS重組質粒酶切驗證；3～4：農桿菌菌液PCR驗證。Note：M：2 000 bp marker. 1：Amplification of ZmPDS gene fragments. 2：Double enzyme cutting validation of pTRV2-ZmPDS recombinant plasmid. 3-4：PCR validation of Agrobacterium bacteria.圖1 玉米ZmPDS基因片段的擴增和VIGS沉默載體的酶切鑒定Fig.1 Amplification of ZmPDS gene of maize and identification of the VIGS silencing vector

注：M：5 000 bp marker；1：ZmMAC3靶標基因片段擴增；2：pTRV2-ZmMAC3重組質粒酶切驗證；3～4：農桿菌菌液PCR驗證。Note：M：5 000 bp marker. 1：Amplification of ZmMAC3 gene fragments. 2：Double enzyme cutting validation of pTRV2-ZmMAC3 recombinant plasmid. 3-4：PCR validation of Agrobacterium bacteria.圖2 玉米ZmMAC3基因片段的擴增和VIGS沉默載體的酶切鑒定Fig.2 Amplification of ZmMAC3 gene of maize and identification of the VIGS silencing vector

2.2 玉米TRV-VIGS體系的優化

穩定、高效、高通量的VIGS體系，是將其應用于玉米抗病基因功能快速鑒定的基本條件。本研究首先完全遵照Zhang等[13]的方法，驗證了應用該方法沉默玉米ZmPDS基因引起的白化表型的效率及其重復性，結果發現ZmPDS基因可以被沉默，并引起整株完全白化，但沉默白化植株的比例僅3%，效率較低，難以實際應用。因此，分別從浸種方法、農桿菌菌株篩選、真空滲入時間、共培養時間等因素對該體系進行優化。

2.2.1 浸種方式的篩選 Zhang等[13]將消毒處理后的玉米種子不經浸種直接進行農桿菌輔助真空滲入處理，觀察發現干燥種子可能不利于農桿菌侵入，因此，本試驗分別使用無菌水、VIGS農桿菌液浸泡玉米種子24 h。結果表明，不浸種處理，VIGS沉默玉米存活率為80.0%，基因沉默效率為3.0%；VIGS農桿菌和無菌水浸種處理，存活率分別降低為51.0%和54.0%，而ZmPDS基因沉默比率(白化率)分別上升至15.9%和28%，浸種處理明顯提高了VIGS沉默效率，無菌水處理組的沉默效率最高，是不浸種的9倍以上(圖3-A)。因此，無菌水浸種24 h，再接種農桿菌是最佳種子預處理條件。

2.2.2 農桿菌菌株的篩選 選用2種不同的農桿菌菌株GV3101和LB4404，分別進行真空滲入輔助農桿菌侵染無菌水浸種24 h后的玉米種子，結果表明，GV3101和LB4404處理的玉米幼苗存活率分別為53.8%、50.4%，不同農桿菌菌株對玉米幼苗存活率影響無明顯差異(P>0.05)，GB3101和LB4404處理的基因沉默效率分別為14.2%和29.3%，LB4404的基因沉默效率是GV3101的2倍以上(圖3-B)。表明，選用農桿菌LB4404菌株可以獲得更高的VIGS沉默效率。

圖3 玉米TRV-VIGS體系的優化Fig.3 Optimization of maize TRV-VIGS system

2.2.3 真空滲入時間的優化 Zhang等[13]使用20 mL注射器和10 mL醫用玻璃瓶進行抽真空滲入60 s，結果發現真空處理時間短，農桿菌侵染可能不夠充分，而且試驗所用器具容量小，不利于大規模處理種子，因此，本試驗改用真空干燥器，并對真空輔助農桿菌滲入時間進行優化，分別設置抽真空20、40、60 min 3個處理。結果表明，基因沉默效率隨真空滲入時間的延長而增加，分別為17.0%、24.1%和25.1%；但幼苗存活率隨著真空滲入時間延遲呈先降低后增加的趨勢，當抽真空20 min處理時存活率最高，為54.0%；真空滲入60 min處理時，存活率達45.3%；農桿菌抽真空滲入60 min處理可以獲得最高的基因沉默效率，同時維持較高的幼苗存活率(圖3-C)。

2.2.4 農桿菌-玉米種子共培養時間的優化 研究表明，將農桿菌與玉米種子進行共培養，玉米的存活率和基因沉默效率均受共培養時間的顯著影響，15 h時基因沉默效率較好[13]。本試驗設置共培養時間為10 h和15 h 2個處理，結果表明，共培養時間對植株的存活率無明顯影響，分別為46.2%和45.2%，植株的基因沉默效率隨共培養時間延長而略有降低，分別為23.9%和20.1%(圖3-D)。因此，10 h處理為最佳共培養時間。

綜上，優化后的基于農桿菌介導的玉米TRV-VIGS體系，包括無菌水浸種24 h后，手術刀將種皮劃破，真空輔助農桿菌LB4404菌液滲入處理玉米種子60 min后共培養10 h，洗凈種子后播種，溫室生長。

2.3 利用TRV-VIGS體系鑒定ZmMAC3基因在玉米頂腐病抗性中的作用

注：A：PTRV1/pTRV2:00對照植株；B：用含pTRV1/pTRV2-ZmPDS農桿菌侵染的植株；C：半定量RT-PCR分析ZmPDS基因的表達；D：接種頂腐病菌7 d后，pTRV2:00對照植株；E：接種頂腐病菌7 d后，含pTRV1/pTRV2-ZmMAC3農桿菌侵染的植株(左一、二：感病植株，右一、二：未感病植株)；F：半定量RT-PCR分析ZmMAC3基因的表達。CK：無菌水處理植株；1和4：pTRV2:00侵染植株中ZmPDS和ZmMAC3基因的相對表達；2和3：pTRV2-ZmPDS沉默植株中ZmPDS基因的相對表達；5和6：感病植株中ZmMAC3基因的相對表達；7和8：未感病植株 中ZmMAC3基因的相對表達。Note: A: pTRV1/pTRV2:00 control plants. B: Plants treated with pTRV1/pTRV2-ZmPDS Agrobacterium tumefaciens. C: Semi-quantitative RT-PCR analysis of ZmPDS gene expression. D: pTRV2:00 control plants infected with the top rot pathogen for 7 d. E: Plants inoculated with pTRV1/pTRV2-ZmMAC3 after infected with the top rot pathogen for 7 d (left one and two: the diseased plants, right one and two: undiseased plants). F: Semi-quantitative RT-PCR analysis of ZmMAC3 gene expression. CK: Sterile water treated plants. 1 and 4: Plants infected with pTRV2:00 and the relative expression of ZmPDS and ZmMAC3. 2 and 3: Relative expression of ZmPDS gene in plants silenced by pTRV2-ZmPDS. 5 and 6: Relative expression of ZmMAC3 gene in susceptible plants. 7 and 8: Relative expression of ZmMAC3 gene in unaffected plants.圖4 TRV介導的玉米VIGS體系及半定量RT-PCR檢測Fig.4 TRV mediated VIGS system in maize and detection by semi-quantitative RT-PCR

MAC3是植物先天免疫和抗病信號通路中的關鍵因子，為了驗證TRV-VIGS方法實際應用的可行性，同時初步分析ZmMAC3在玉米頂腐病抗性中的作用，利用優化的玉米TRV-VIGS體系，以抗頂腐病品種先玉335為研究材料，以接種pTRV1/pTRV2-ZmPDS農桿菌為VIGS對照、以接種pTRV1/pTRV2:00農桿菌進行VIGS沉默處理后接種亞粘團鐮孢菌為對照，觀察接種pTRV1/pTRV2-ZmMAC3農桿菌VIGS沉默處理再接種亞粘團鐮孢菌后玉米頂腐病抗性表現。結果表明，接種VIGS處理14 d后，pTRV1/pTRV2:00農桿菌侵染種子的玉米幼苗未出現白化表型，葉片仍為綠色(圖4-A)；pTRV1/pTRV2-ZmPDS農桿菌侵染種子的玉米幼苗出現整株完全白化表型(圖4-B)；RT-PCR半定量分析結果表明，白化玉米植株中ZmPDS轉錄水平明顯低于對照(圖4-C)，說明ZmPDS得到了有效沉默。pTRV1/pTRV2:00農桿菌侵染的植株，接種亞粘團鐮孢菌后，玉米幼苗正常生長，沒有明顯病癥表現(圖4-D)，表明先玉335對頂腐病具有較強的抗性；而VIGS沉默ZmMAC3的先玉335接種亞粘團鐮孢菌后部分幼苗表現出生長緩慢，植株矮小，葉尖變黃干枯，頂端葉片或心葉卷曲纏繞等典型的玉米頂腐病癥狀(圖4-E)；半定量RT-PCR檢測結果表明，VIGS沉默處理的植株中表現典型頂腐病病癥的個體的ZmMAC3轉錄水平均較低，而未表現病癥的單株ZmMAC3轉錄水平接近正常對照水平(圖4-F)。表明ZmMAC3是玉米頂腐病抗性所必需的重要基因。將單株表型鑒定與沉默基因RNA水平的定量或半定量分析相結合，可以應用于玉米功能基因的VIGS分析鑒定。

3 討論

目前已有40多種病毒被改造為VIGS載體，其中約37種可以應用于雙子葉植物基因沉默[7-8]，而適用于單子葉植物的VIGS載體卻僅有幾個。BSMV、BMV是目前廣泛應用于禾谷類植物基因功能的VIGS工具，但它們的接種方式高度依賴于基因槍[22]、體外轉錄摩擦接種[21, 23-24]或在本氏煙草這樣的中介宿主植物預接種[25]。據報道BMV[24]、CMV、ZMBJ-CMV[10]、FoMV[11-12]已成功應用于玉米VIGS，但是沉默ZmPDS基因只能導致部分白化癥狀，說明玉米這些VIGS體系可能不能作用于整株水平，持續時間短。雖然有利用BMV載體通過農桿菌真空滲入法成功沉默水稻基因的報道，但是未見應用報道。TRV應用于VIGS試驗具有接種簡便、無需RNA操作、試驗周期短等優點，已在番茄[26]、煙草[27]、擬南芥[28]、麻風樹、矮牽牛[29]、棉花[30]等雙子葉植物上成功應用，但極少應用于單子葉植物。最近，Zhang等[13]通過農桿菌真空滲入與共培養相結合將TRV-VIGS體系成功應用于小麥和玉米基因的沉默，克服了BMV、CMV、FoMV、BSMV等介導的VIGS的缺點，可在整株植物水平上起作用。此外，該方法通過種子處理，由農桿菌介導，還可以克服傳統的TRV-VIGS采用的葉片接種農桿菌難以完全抑制整個植物水平的基因轉錄消減，以及難以通過VIGS沉默研究注射葉片以下(根、下胚軸等)組織以及植物早期發育的基因功能等不足。但是Zhang等[13]報道的方法，只適用于處理少數幾粒種子，而在本試驗條件下，沉默ZmPDS的比例僅3.0%，很難實際應用。因此，本試驗從浸種處理、農桿菌菌株、真空滲入時間、共培養時間等試驗條件因素進行了優化，優化后的玉米TRV-VIGS體系無論沉默ZmPDS導致植株出現光漂白癥狀的比率，還是沉默ZmMAC3后接種亞粘團鐮孢菌而引起抗頂腐病玉米品種先玉335感染發病的比例均穩定在25%以上，而且表現光漂白或感病癥狀的植株其對應植株中的ZmPDS或ZmMAC3的轉錄水平均明顯降低，而不表現沉默癥狀的單株對應的ZmPDS或ZmMAC3的轉錄水平都無明顯變化，基因的轉錄水平與癥狀之間出現高度相關性。因此，將單株表型鑒定與VIGS沉默基因的轉錄水平分析相結合，可以應用于玉米基因功能的鑒定。

TRV-VIGS體系的沉默效率取決于病毒的繁殖傳播與植物生長之間的動態互作[31]。TRV通過農桿菌介導進入玉米細胞，表達TRV病毒，因此影響農桿菌侵入玉米組織的試驗條件因素可能起決定性作用。本研究也證實了這一觀點，即農桿菌菌株、浸種方法、真空滲入時間和共培養時間均對VIGS效率產生了不同程度的影響。真空輔助農桿菌滲入法能夠增加植物遺傳轉化效率，尤其適用于對真空滲入具有高抗性的植物[32]。玉米種子能夠承受長時間真空滲透，本研究中真空滲入時間長達60 min，雖然育種種子存活率下降，但基因沉默效率最佳。干燥的種子不利于農桿菌侵染，所以本試驗采用了無菌水和農桿菌浸種的方法，先浸種，再進行真空滲透，VIGS沉默效率大幅度提高，是改良的玉米TRV-VIGS體系最關鍵的步驟。將玉米種子與農桿菌共培養適當時間，可以增加受侵染植物細胞的比例，提高VIGS基因沉默效率，但共培養時間過長時VIGS的效率反而降低，這是否是由于農桿菌過度老化，活性下降，導致沉默效率降低還有待進一步研究。此外，本試驗發現LB4404對玉米基因沉默的效率較高，可能與植物對不同農桿菌菌株具有不同的敏感性有關[33-34]，而容易侵染的玉米受體則有利于病毒RNA的轉錄，從而提高VIGS沉默效率。但本研究所使用的受體玉米品種和農桿菌菌株種類有限，下一步可擴大受體玉米品種的篩選范圍和農桿菌菌株種類以提高VIGS有效沉默效率。本研究中，優化后的TRV-VIGS體系的沉默效率最高也只有29.3%，雖然結合單株目標基因轉錄水平檢測可以鑒定基因的功能，但是70%以上沒有沉默的植株可能會給沉默基因的表型鑒定帶來困擾，同時，轉錄水平分析的工作量較大。因此，需要進一步改良。pTRV1和pTRV2都是使用兩個串聯35S啟動子啟動TRV和插入靶標基因部分序列的RNA轉錄；35S啟動子在單子葉植物中是一種較弱的啟動子，因而也可能影響VIGS效率；pUbi啟動子在玉米中的啟動效率是35S的10倍以上，以pUbi取代35S啟動子也有可能大幅度提高TRV-VIGS在單子葉植物中的效率[35]。

MAC是植物剪接體中的起活化和調控作用的重要組分，對于RNA剪接和miRNA合成等具有重要調控作用。擬南芥突變體mac3a和mac3b以及VIGS沉默棉花GhMAC3都能導致植物免疫或抗病能力顯著下降，但是它們在單子葉植物中免疫和抗病作用尚未見報道。先玉335高抗玉米頂腐病。本研究利用優化的TRV-VIGS技術沉默玉米中同源基因mMAC3，發現ZmMAC3沉默后的植株對亞粘團鐮孢菌高度敏感，表現出葉尖變黃干枯，頂端葉片或心葉卷曲纏繞等典型的玉米頂腐病癥狀，優化后的玉米TRV-VIGS體系可以實際應用于玉米苗期抗病基因的功能分析。表明，MAC和MAC3在單子葉植物免疫和抗病反應中可能同樣起關鍵作用，這為進一步研究玉米MAC參與的免疫分子機制提供了一定的理論參考。

4 結論

本研究從浸種處理、農桿菌菌株、真空滲入時間、共培養時間4個試驗因素對玉米TRV-VIGS體系進行優化，得到高效、穩定的VIGS體系，包括無菌水浸泡種子24 h后，剝去胚部種皮，LB4404農桿菌菌株真空滲入處理60 min，再共培養10 h。應用該體系，成功抑制了玉米ZmMAC3基因表達，與對照相比，ZmMAC3抑制表達的玉米植株接頂腐病菌后，更易感病。優化的玉米TRV-VIGS體系具體快速、高效、可使植株整株沉默等特點。本研究結果為玉米重要基因鑒定和功能分析的研究奠定了一定的理論基礎。