甘蔗抗褐銹病基因定位親本間多態性SSR標記篩選

單紅麗 李文鳳 黃應昆 王曉燕 張榮躍 李 婕 尹 炯 倉曉燕

(云南省農業科學院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠 661699)

甘蔗褐銹病(Sugarcane brown rust)是由黑頂柄銹菌(PuccinamelanocephalaH. Sydow &P. Sydow)引起的一種流行性真菌病害，普遍存在于世界各國的甘蔗種植區[1-3]。據統計，甘蔗褐銹病可導致甘蔗減產10%～40%，蔗糖含量下降10%～36%[4]，導致一些豐產高糖品種如CP78-1247、CL41-23等被淘汰[5-6]，桂糖15號、桂糖17號、臺糖86-1626、Mex105、P44、粵糖60號、德蔗03-83等面臨淘汰[3,7]，以及福農41、云蔗09-1601等優良品種難以推廣[8]。甘蔗褐銹病已成為影響甘蔗產業的主要病害之一。1996年Daugrois等[9]首次在甘蔗品種R570上發現抗褐銹病主效基因Bru1，隨后國內外研究者進行了大量研究證實Bru1是世界甘蔗遺傳基礎中褐銹病抗性的主要來源[10-12]。但由于甘蔗褐銹病病原菌會隨著寄主抗性基因的選擇而發生突變，難以徹底消滅褐銹病。因此，不斷發掘新的褐銹病抗性基因，選育持久抗性品種對延長品種抗性壽命、抑制甘蔗褐銹病流行具有重要意義。

近年來，DNA分子標記技術的迅猛發展，極大地促進了甘蔗遺傳連鎖圖譜的構建，進一步提高了甘蔗抗病基因定位的可靠性[13]。目前，限制性片段長度多態性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)、隨機擴增多態性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、簡單重復序列(simple sequence repeat，SSR)、擴增片段長度多態性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)等分子標記已被廣泛應用于甘蔗的研究，其中SSR標記因具有多態性高、共顯性遺傳、穩定性好、標記均勻分布于全基因組等優點，已成為甘蔗遺傳圖譜構建和抗病基因定位中最主要的標記之一[14]。如Piperidis等[15]利用SSR標記構建了Q117和MQ77-340的遺傳圖譜；劉新龍等[16]利用SSR標記構建了一個雜交和一個回交群體的遺傳圖譜；Andru等[17]利用SSR標記構建了美國路易斯安那州主栽品種LCP85-384的遺傳圖譜；Raboin等[18]利用SSR標記構建了R570和MQ76-53的遺傳圖譜，并在MQ76-53的遺傳圖譜上定位了1個控制紅色蔗莖的基因和1個抗褐銹病的新基因；楊翠鳳[19]利用SSR標記分別構建了母本GXS85-30和父本GXS87-16的分子遺傳圖譜，并在父母本遺傳圖譜上共檢測到控制黑穗病性狀的4個主效QTL和51個微效QTL。雖然甘蔗分子遺傳連鎖圖譜相繼被構建，但由于甘蔗是異源多倍體, 基因組血緣組成高度復雜, 染色體數量龐大，所以這些圖譜的覆蓋范圍仍然較小, 且標記間遺傳距離較大, 圖譜飽和度低，因此，需要篩選更多可用于構建遺傳圖譜的分子標記。

褐銹病抗性通常被認為是一種具有較高遺傳力的數量遺傳性狀[20]。高密度的遺傳圖譜有助于基因定位、基于圖譜的基因克隆和精確分析數量性狀基因，而構建高密度的遺傳圖譜需要大量多態性豐富的分子標記[21]。本研究選擇6個高抗褐銹病不含Bru1基因的甘蔗品種(可能含有新的抗病基因)和6個高感褐銹病的甘蔗品種進行配置雜交組合，篩選在各雜交組合抗病和感病親本間條帶清晰、多態性明顯、重復性較好的SSR標記，旨在提供更多遺傳連鎖圖譜構建可用的多態性標記，以期為開展甘蔗抗褐銹病基因定位和分子標記輔助選擇奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從國家甘蔗種質資源圃(云南開遠)中選擇6個高抗甘蔗褐銹病不含Bru1的品種(粵糖00-236、粵糖93-159、德蔗93-88、ROC24、滇蔗茅95-19、滇蔗茅95-20)和6個高感甘蔗褐銹病的品種(Mex105、ROC26、德蔗03-83、粵糖03-393、柳城03-1137、云蔗06-407)，根據感病母本×抗病父本原則選配12個雜交組合，12個組合詳見表1。

1.2 基因組DNA的提取和檢測

各材料分別采集充分展開的第1片新葉，按照植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術公司)說明書提取葉片總DNA，利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀(Eppendorf公司，德國)檢測DNA濃度及純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，-20℃保存備用。

1.3 SSR引物篩選

通過查閱文獻及在甘蔗表達序列標簽數據庫(Sugarcane Expressed Sequence Tag Database)上搜索引物序列信息，最終選取前人[22-27]研究報道在甘蔗上具有較好多態性的84對SSR引物，由上海生工生物公司合成。以12個雜交組合親本材料基因組DNA為模板，先對84對SSR引物進行初篩，選出在不同組合親本間具有差異的引物，然后再對初篩所得引物進行復篩，最后獲得各個組合親本間條帶清晰、多態性明顯、重復性較好的引物。

1.4 SSR-PCR擴增

PCR擴增體系為10 μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技術公司)4.5 μL，模板DNA(20 ng·μL-1)0.5 μL，上、下游引物(10.0 μmol·L-1)各0.5 μL，然后加無菌ddH2O補足至10 μL。SSR-PCR反應程序為94℃預變性4 min; 94℃變性15 s, 54℃退火15 s,72℃ 延伸1 min, 35個循環；72℃終延伸5 min，4℃保存。

1.5 擴增產物的電泳分離

擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，采用銀染法進行染色，輕搖至DNA條帶顯示清晰，然后倒掉顯色液，用蒸餾水漂洗2遍，觀察記錄帶型并照相。

2 結果與分析

2.1 DNA質量檢測

對12份親本材料的DNA濃度和質量進行檢測，所提取DNA的OD260/OD280均介于1.7～1.9 之間。由圖1可知，提取的DNA為一條清晰完整的帶，條帶大小一致，無蛋白質和RNA污染。說明提取的DNA完整，純度高，符合要求。

2.2 抗性親本間SSR標記多態性分析

84對SSR引物在12個雜交組合親本間的多態性分析結果表明，父本相同的雜交組合親本間多態性引物數各不同，母本相同的雜交組合親本間多態性引物數也不同。柳城03-1137×德蔗93-88具有最多的多態性引物數，為44對，多態性比率也最高，為52.38%；Mex105×粵糖00-236的多態性引物數次之，為40對，多態性比率為47.62%；ROC26×粵糖93-159多態性引物數最少，為25對，多態性比率最低，為29.76% (表1)。

2.3 SSR 多態性標記篩選

對各組合初篩所獲得的多態性引物進行復篩，由表2可知，不同親本組合獲得的多態性引物數介于6～11對，其中5-mSSCIR13、6-mSSCIR14等11對引物在德蔗03-83×滇蔗茅95-20中具有穩定多態性；18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等10對和6-mSSCIR14、14-mSSCIR27等10對引物分別在組合柳城03-1137×德蔗93-88和德蔗03-83×滇蔗茅95-19中具有穩定多態性；13-mSSCIR26、19-mSSCIR35等9對引物在Mex105×ROC24中具有穩定多態性；22-mSSCIR38、32-mSSCIR67等8對和6-mSSCIR14、40-mSSESTB06等8對和5-mSSCIR13、14-mSSCIR27等8對引物分別在組合云蔗06-407×粵糖93-159、粵糖03-393×滇蔗茅 95-19和粵糖03-393×滇蔗茅95-20中具有穩定多態性；22-mSSCIR38、25-mSSCIR48等7對，18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等7對，32-mSSCIR67、34-mSSESTA03等7對和20-mSSCIR36、27-mSSCIR53等7對引物分別在組合Mex105×粵糖00-236、德蔗03-83×粵糖93-159、粵糖03-393×ROC24和ROC26×德蔗93-88中具有穩定多態性；32-mSSCIR67、52-mSSCIR51等6對引物在ROC26×粵糖93-159中具有穩定多態性，表明這些引物可以用于后期遺傳圖譜的構建。

注：1～6： 6個高感褐銹病親本材料；7～12∶6個高抗褐銹病親本材料。Note: 1-6: 6 highly susceptible parents to sugarcane brown rust. 7-12: 6 highly resistant parents to sugarcane brown rust.圖1 12份抗、感甘蔗褐銹病親本材料基因組DNA檢測結果Fig.1 Detection result of genomic DNA for 12 resistant and susceptible parents to sugarcane brown rust

表1 甘蔗抗銹病基因定位親本間SSR多態性分析Table 1 Polymorphic SSR markers analysis between resistant and susceptible parents for localization of brown rust resistance gene

由圖2和圖3可知，40號以后的引物多態性較好，其中2對引物75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*不僅在多態性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中條帶清晰、差異大，而且在以德蔗03-83為母本的3個組合中多態性也較好，另外在ROC26×粵糖93-159中多態性也豐富，說明這2對引物穩定性較高。

表2 親本間多態性較好SSR標記信息Table 2 The information of good polymorphic SSR markers between resistant and susceptible parents

注：M：DNA marker (100 bp ladder)；46～84：在親本柳城03-1137×德蔗93-88間初篩出的多態性引物編號。箭頭所指為雙親差異明顯的帶。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 46-84: The polymorphic SSR primers number in Liucheng 03-1137 × Dezhe 93-88. The arrows point out different bands between parents.圖2 24對SSR引物在親本柳城03-1137×德蔗93-88間復篩的電泳圖Fig.2 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Liucheng 03-1137×Dezhe 93-88

注：M： DNA marker (100 bp ladder)；39～78：在親本德蔗03-83×滇蔗茅95-19間初篩出的多態性引物編號。箭頭所指為雙親差異明顯的帶。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 39-78: The polymorphic SSR primers number in Dezhe 03-83 × Dianzhemao 95-19. The arrows point out different bands between parents.圖3 24對SSR引物在親本德蔗03-83×滇蔗茅95-19間復篩的電泳圖Fig.3 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Dezhe 03-83× Dianzhemao 95-19

3 討論

甘蔗是高度異質性的異源多倍體植物，其染色體數量較大(2n=100～130)，且遺傳距離也較大(18 000 cM)[28]，遺傳基礎復雜，因此構建飽和圖譜是有效定位主要基因的基礎。Asnaghi等[29]利用R570的精細遺傳圖譜定位了甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1。在構建精密的遺傳圖譜前首先要確定親本組合，若親本材料選取不當，會影響圖譜的構建以及準確性[30]。Racedo等[10]、李文鳳等[31]和Li等[12, 32]利用與Bru1緊密連鎖的R12H16和9020-F4標記對甘蔗種質、品種和育種材料進行褐銹病抗性的鑒定和評價，發現一些表型抗病但標記檢測呈陰性的材料，暗示這些材料除了Bru1外還可能存在其他的抗褐銹病基因，可作為甘蔗褐銹病潛在替代抗性來源。本研究選擇了6個高抗褐銹病不含Bru1基因的甘蔗品種(可能含有新的抗病基因)為父本，與6個高感褐銹病的甘蔗品種配置12個雜交組合，利用84對SSR引物進行了抗病和感病親本之間的多態性分析。結果發現組合柳城03-1137×德蔗93-88和組合Mex105×粵糖00-236親本間多態性引物最多，分別為44對和40對，多態性比率最高，分別為52.38%和47.62%。表明以柳城03-1137×德蔗93-88、Mex105×粵糖00-236為親本材料構建作圖群體，更有利于利用分子標記對控制甘蔗褐銹病抗性數量性狀位點進行精細定位和目標基因的圖位克隆。

研究表明，構建遺傳圖譜的過程中，用于構建圖譜的標記越多，圖譜越密，準確性越高，更有利于進行抗病基因精細定位和圖位克隆[33]。如Yang等[34]從 6 149 對SSR引物中篩選出了1 095對與高粱具有一致性的引物，進一步研究發現其中96對引物能用于甘蔗高密度遺傳圖譜構建和黃銹病抗性數量性狀定位。楊翠鳳[19]從80對SSR引物中篩選出了50對多態性穩定、條帶清晰的標記用于割手密高密度遺傳圖譜的構建和黑穗病抗性QTL定位。本研究以篩選出擴增條帶清晰、多態性明顯、重復性好的引物為目標，對各個組合初篩獲得的多態性SSR引物進行了復篩，在多態性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中獲得了 18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*共10對具有穩定多態性引物，在Mex105×粵糖00-236中獲得了22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*共7對具有穩定多態性引物。因此，用篩選得到的10對多態性引物用于柳城03-1137×德蔗93-88為親本材料的作圖群體，7對多態性引物用于Mex105 ×粵糖00-236為親本材料的作圖群體，將更有利于構建分子遺傳圖譜。

4 結論

本研究結果表明，在6個高抗甘蔗褐銹病品種和6個高感甘蔗褐銹病品種為親本組成的12個雜交組合中，組合柳城03-1137×德蔗93-88多態性引物數最多，多態性比率最高；其次是組合Mex105×粵糖00-236。從84對SSR引物中篩選到10對(18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*)在組合柳城03-1137×德蔗93-88親本間多態性最好的引物，7對(22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*)在Mex105×粵糖00-236親本間多態性最好的引物，下一步可分別用于2個組合的作圖群體。篩選出的親本間多態性SSR引物將有助于甘蔗抗褐銹病新基因分子標記定位。本研究結果為后續抗褐銹病新基因定位和開發與其緊密連鎖的分子標記奠定了一定的理論基礎。