禽流感高敏熒光免疫分析快檢試劑盒的研制與應(yīng)用

王澤洲，吳俊清，章健，吳冠英，陳弟詩，賀冬梅

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

由于H7N9亞型禽流感對人具有傳染性和致死率，可能對公共衛(wèi)生安全和社會穩(wěn)定造成較大的危害和影響，因此對該病的早期診斷、監(jiān)測非常重要。本研究應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物，研制了一種既簡單方便、快捷，又準(zhǔn)確、特異、敏感的禽流感高敏熒光免疫分析快速檢測試劑盒（LFICA）。現(xiàn)將初步研究結(jié)果報告如下:

1 材料和方法

1.1 材料禽流感（AI）通用型單抗，禽流感H7亞型單抗，羊抗兔IgG抗體、兔IgG抗體，H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原，新城疫（ND）抗原和雞傳染性支氣管炎（IB）抗原等，雞泄殖腔和咽喉拭子樣品由相關(guān)合作單位提供。吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機(jī)、點(diǎn)膜與噴金膜機(jī)，鑭系熒光納米微球和熒光儀，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。制備包被膜、抗體標(biāo)記微球、雙抗體夾心法建立等，均參照說明書或按照相關(guān)要求操作。

1.2 熒光免疫分析試紙條的組裝在濕度小于30%，溫度20～25℃的環(huán)境下，把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條（圖1），將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 鑭系熒光免疫層析法結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原和陰性樣本建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)陽性抗原和陰性樣本由本單位提供。

1.4 特異性試驗選取H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原、新城疫抗原等陽性樣品，稀釋40倍，應(yīng)用禽流感高敏熒光免疫分析試紙條檢測，同時設(shè)空白和陰性對照，以確定該方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.5 敏感性試驗將H9、H7、H5、H3標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原進(jìn)行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1:10 240倍比稀釋，每個稀釋度平行做4個重復(fù)，分別用建立的通用型和H7亞型AI-LFICA試劑盒檢測，判斷抗原檢出滴度。

1.6 重復(fù)性試驗在相同條件下，選取8份AIV抗原含量不同的樣本，每份樣本平行做10個重復(fù)，分別用組裝的通用型和H7亞型AI-LFICA試劑盒檢測（批號為20180613），同時對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 比較試驗用同一份樣本同時進(jìn)行HA、Bionote試紙條、熒光RT-PCR和AI-LFICA檢測，并對結(jié)果作比較，計算AI-LFICA相對于其他試劑盒的符合率、敏感性和特異性。

1.8 試劑盒的組裝及保存期試驗AI-LFICA試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4℃保存（37℃），于保存后不同時間，按照AI-LFICA各個優(yōu)化條件，對AIV陽性和陰性參考樣品進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 試劑盒應(yīng)用試驗取100份雞咽喉拭子樣品，用通用型AI-LFICA試劑盒和RT-PCR同時檢測，比較結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 測定條件選擇

2.1.1 標(biāo)記量的選擇把標(biāo)記好的質(zhì)量比（抗體/微球）不同的熒光微球稀釋相同倍數(shù)，組裝成檢測卡，在檢測卡加樣孔中分別加入80μL參考樣本，室溫下層析15 min，檢測，考察并驗證不同標(biāo)記量對標(biāo)記結(jié)果的影響。結(jié)果表明，隨標(biāo)記抗體濃度的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)抗體/微球的質(zhì)量比為1∶25時曲線有拐點(diǎn)，以后漸平。因此，選擇標(biāo)記比例為1∶25的免疫微球進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

2.1.2 加樣量的選擇在其他條件一致的情況下，考察并驗證樣本不同加樣量對檢測結(jié)果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入50、60、70、80、90、100、110μL參考樣本，室溫下反應(yīng)15 min后檢測。結(jié)果表明，隨加樣量的增加，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率均增加。當(dāng)樣本加樣量為80μL時，繼續(xù)增加加樣量，結(jié)合率增加不明顯，認(rèn)為此時試紙條上的免疫反應(yīng)基本飽和。因此，后續(xù)實(shí)驗選擇80μL為樣本加樣量。

2.1.3 檢測時間的選擇在檢測卡加樣孔中加入80μL參考樣本，室溫下免疫反應(yīng)，分別在5、10、15、20、25、30 min時檢測，考察不同檢測時間對結(jié)果的影響。結(jié)果表明，隨檢測時間的延長，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率呈現(xiàn)增加的趨勢，在15 min時檢測能達(dá)到較高的結(jié)合率，而隨著檢測時間的延長，各濃度點(diǎn)的結(jié)合率不再發(fā)生較大的變化，趨于平穩(wěn)或減少，說明在15 min時試紙條上的雙抗體夾心吸附基本達(dá)到飽和。因此，本著快速簡便的原則，選擇檢測時間為加樣后15 min。

2.2 檢測結(jié)果判讀加樣后，由于液體向前移動，先后與包被在T線和C線上的抗體形成復(fù)合物，這時試紙條經(jīng)熒光檢測設(shè)備掃描顯示出2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗原濃度的增加而升高。相應(yīng)的檢測結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，熒光值信號為縱坐標(biāo)，經(jīng)對數(shù)函數(shù)數(shù)據(jù)處理程序擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)樣本為陰性時，AIV濃度很低或無，T線熒光值很低或完全檢測不到；當(dāng)樣本為陽性時，AIV抗原濃度越高，T線熒光值也越高。無論是陽性還是陰性結(jié)果，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現(xiàn)，無論T線有無，這時的結(jié)果均判為無效。

2.3 AI-LFICA試劑盒的方法學(xué)評估

2.3.1 特異性試驗用AI-LFICA試劑盒分別檢測H9、H7、H5、H3亞型禽流感抗原，雞新城疫（ND）和雞傳染性支氣管炎（IB）陽性抗原，結(jié)果（表1）表明，AI（通用）-LFICA與所有亞型禽流感抗原均有反應(yīng)，AI（H7）-LFICA只與H7亞型有反應(yīng)；禽流感通用型和H7亞型LFICA與ND、IB陽性抗原均不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的特異性。

表1 特異性試驗結(jié)果

2.3.2 敏感性試驗當(dāng)H7亞型抗原樣本稀釋至1 280倍時，用AI（H7）-LFICA檢測仍為陽性（見 表2）。用AI（通用）-LFICA檢測不同亞型陽性抗原樣本時，不同亞型的稀釋度不一樣，最高是H5可達(dá)到5120倍，最低是H3為640倍（見表3）。證明該方法敏感性很好。

表2 禽流感H7亞型敏感性試驗結(jié)果

表3 禽流感通用型敏感性試驗結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗選擇不同濃度的8個H7陽性樣本，用AI（H7）-LFICA檢測10次，得出批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于10%；選取不同濃度的H9、H7、H5、H3陽性樣本，用AI（通用）-LFICA分別檢測10次，得出批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均小于10%。以上結(jié)果表明禽流感通用型和H7亞型LFICA試劑盒具有良好的重復(fù)性。

2.3.4 與HA、Bionote試紙條和熒光RT-PCR的比較試驗同一份H9、H7、H5陽性樣品，同時用AI-LFICA、HA、Bionote試紙條和熒光RT-PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，用熒光RT-PCR檢測3種禽流感亞型的滴度達(dá)到或高于1∶40 960；AI-LFICA檢測滴度優(yōu)于HA，且檢測H7的滴度明顯優(yōu)于Bionote試紙條（表4）。

表4 比較試驗結(jié)果

2.3.5 試劑盒保存期試驗用一批試劑盒于37℃放置一周，每天檢測，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得出，用AI-LFICA試劑盒檢測陽性樣品、陰性樣品、P/N值的變異系數(shù)均小于10%，表明該產(chǎn)品很穩(wěn)定。將該試劑盒放置于4℃，每月檢測一次，目前已放置180 d，檢測效果基本一致，說明該診斷試劑盒穩(wěn)定有效，進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗還在進(jìn)行中。

2.3.6 試劑盒應(yīng)用試驗取100份雞咽喉拭子樣品，分別用通用型試劑盒和RT-PCR方法進(jìn)行檢測，得出共同陽性樣品數(shù)為2份，共同陰性樣品數(shù)為94份，由此得出兩種方法的符合率為96%。

3 討論

3.1 禽流感抗原檢測方法中，中和試驗是經(jīng)典方法，但由于涉及細(xì)胞繁殖、病毒培養(yǎng)、染色標(biāo)記等復(fù)雜操作，對實(shí)驗儀器和操作人員要求較高，加上檢測周期長，故很難在普通實(shí)驗室應(yīng)用。ELISA和RT-PCR是禽流感病毒抗原檢測的主要方法，具有敏感性好和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完備的實(shí)驗設(shè)備，操作人員也得具有一定的專業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)驗，檢測一批樣品的整個流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫(yī)站和一般實(shí)驗室不適用。本試驗建立的高敏熒光免疫分析方法（LFICA）是在時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎(chǔ)上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術(shù)，它集合了酶標(biāo)記技術(shù)、放射標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，無污染，測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和非放射性等優(yōu)點(diǎn)，已受到各領(lǐng)域科研工作者的關(guān)注。在人醫(yī)學(xué)界已有文獻(xiàn)報道，在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域才起步，需要研究的內(nèi)容和范圍還很多【1-3]。

3.2 本研究所用的單克隆抗體是整個試驗的關(guān)鍵，單克隆抗體的質(zhì)量、純度、表位情況等對抗原的檢測非常重要。對比試驗結(jié)果表明，用熒光RT-PCR檢測3種亞型禽流感抗原的效果最好；AI-LFICA檢測滴度優(yōu)于HA，且檢測H7的滴度優(yōu)于Bionote試紙條，基本能滿足初篩需要。應(yīng)用單抗建立的LFICA試劑盒對不同亞型抗原的檢測滴度不同，這可能是由單抗的表位因素決定的，如果有多株單抗同時應(yīng)用，效果會更加理想。本研究建立的AI-LFICA與鄭騰等[4]和張險朋等[5的研究結(jié)果一致。

3.3 本研究建立的AI-LFICA，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡單、方便、適于基層的優(yōu)點(diǎn)，又具有ELISA和RT-PCR方法敏感、特異、微量的優(yōu)點(diǎn)，檢測時間從2～4 h縮短到十多分鐘，檢測不需要有經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)人員，檢測設(shè)備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場和技術(shù)服務(wù)人員使用。