60Co-γ射線輻射對翠冠和玉露香梨枝條的生物損傷效應

石新杰 吳 瀟 陳楊楊 曹 鵬 白 冰 李明智 殷 豪,* 張紹鈴

(1 南京農業大學梨工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2 南京集思慧遠生物科技有限公司，江蘇 南京 210014)

梨為薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomaceae)梨屬(PyrusL.)多年生木本果樹。我國不僅是梨的起源地，也是世界第一大產梨國，梨已成為我國第三大果樹樹種，具有極高的經濟價值[1]。目前我國梨新品種選育主要是通過雜交育成，但木本果樹雜交育種存在周期長、效率低等問題，而輻射誘變育種具有突變率高、突變譜寬、改良單一性狀效果顯著、性狀能夠快速穩定、育種周期短等優點，已成為創造果樹新種質的有效途徑[2]。1927年，Muller[3]首次發現X射線可以誘導果蠅某些性狀發生突變。經過多年的發展，目前主要的物理誘變包括X、γ、β射線，熱中子輻射、紫外線、激光、離子注入等[2]，其中60Co-γ作為一種有效的物理誘變劑，在果蔬和花卉品種的培育與改良中得到了大量應用，包括柚子[4]、澳洲堅果[5]、蘋果[6]、香蕉[7]、葡萄[8]、辣椒[9]、牡丹種子[10]、菊花[11]、小麥[12]、菠蘿[13]等，并獲得了一大批優質性狀突變體，且部分經過誘變獲得的品種已經在生產上得到了廣泛的應用。

我國梨輻射誘變研究始于1980年，蔣洪業[14]通過輻射梨休眠枝得到抗寒輻向陽紅梨；李志英等[15]利用60Co-γ射線輻射朝鮮洋梨和蘋果梨枝條，并育成具有早果、豐產、抗寒、樹體矮化、抗腐爛病、果品質優等特點的優良品系(如朝輻1號、朝輻2號等)；孟玉平等[16]利用60Co-γ射線輻射普通巴梨自然雜交的種子，培育出豐產性和抗逆性優良的新品種晉巴梨。此外，對于碭山酥梨[17]和庫爾勒香梨[18]的休眠枝輻射也進行了研究，發現隨著輻射劑量的增加，萌芽率、新梢生長量和嫁接成活率均降低。國外對梨輻射誘變也進行了大量研究，如日本研究者通過60Co-γ射線分別輻射長二十世紀、二十世紀和新水梨獲得了抗黑斑病的新品種長二十世紀IRB-502-12T[2]、金二十世紀[19]和壽新水[20]。荷蘭和英國的果樹育種家通過輻射處理獲得了早熟、矮化突變系[21]。雖然當前國內外科研工作者在梨誘變育種取得一些成績，但仍存在鑒定方法不完善、突變方向和性質難掌握等問題。

翠冠梨是浙江省農業科學院園藝研究所以幸水×(杭青×新世紀)雜交培育成的優質早熟豐產梨品種，其具有果個大、肉質酥脆、石細胞少、汁多味甜、抗逆性強等特點，已成為我國長江流域及其南方地區發展最為迅速的早熟梨品種之一[22]。玉露香梨是山西果樹研究所以庫爾勒香梨×雪花梨雜交培育成的優質、耐藏、中熟梨優質新品種，具有果個大、果心小、果肉細、風味佳、成熟早、供應期長等特點[23]。本試驗利用60Co-γ射線對翠冠梨和玉露香梨的休眠枝條進行輻射誘變處理，研究輻射對二者的生物損傷效應，旨在通過輻射誘變改善翠冠梨表皮果銹和玉露香梨在南方區域種植僵芽、區域性強等缺點，以期為梨輻射誘變育種，創制優異梨種質資源提供一定的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料取自南京農業大學梨工程技術中心湖熟試驗基地6年生翠冠和玉露香梨樹一年生枝條，于休眠期剪取，每個品種每個處理剪取30根枝條，每個枝條帶3～4個飽滿芽。枝條剪取后立即用報紙包裹嚴實，并用清水打濕，0℃保存備用。

剪取的枝條在南京航空航天大學材料科學與技術學院進行60Co-γ輻射處理，輻射劑量分別20、30、40、50 Gy，劑量率為1 Gy·min-1，輻射時間分別為20、30、40、50 min，以未經輻射處理的枝條為對照(control，CK)。經輻射處理的枝條于次日嫁接于江浦試驗基地生長較好的7年生梨樹，嫁接后其他措施同常規管理，觀察其生長情況。

1.2 方法

1.2.1 生長指標及葉綠素含量測定 于嫁接6個月后調查各處理的嫁接成活率、新梢生長量、葉片形態、二叉枝和多叉枝分別占總枝量的比例。

嫁接成活率=成活的枝條數量/總的枝條數量×100%

(1)

二叉枝和多叉枝占總枝量的比例=二叉枝和多叉枝的數量/總的枝條數量×100%

(2)。

利用SPAD-502DL Plus葉綠素含量測定儀(日本Konica Minolta公司)測定葉片相對葉綠素(soil and plant analyzer development，SPAD)含量。

1.2.2 感病葉片病菌鑒定 采用組織分離法[24]。分別用刀切取2種梨葉片病健交界處組織，經表面消毒(75%乙醇、1%次氯酸鈉)處理，從葉片上分離得到2種菌落形態的疑似真菌病原物。采用CTAB法分別提取菌絲DNA[25]，以DNA為模板，利用ITS1和ITS4引物進行PCR擴增，產物經凝膠DNA純化、測序公司測序，最終獲得ITS序列。利用NCBI BLAST對2個菌株的ITS序列進行比對分析。

1.2.3 數據統計與分析 主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLSS-DA)采用SIMCA-P軟件(V11.0, Umetrics, Ume?, Sweden)進行計算和繪制。試驗數據采用Microsoft Office Excel 2016軟件進行統計和分析，所有圖片通過Photoshop軟件進行組合。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ輻射對梨接穗成活率的影響以及對葉片、枝條的生物損傷效應

由表1可知，枝條嫁接成活率隨輻射劑量的增加而降低。與CK相比，50 Gy處理的翠冠和玉露香枝條接穗成活率最低，分別為66.67%和60.00%。表明輻射處理具有一定致死效應，并隨著輻射劑量的增加，致死效應越明顯。CK和20 Gy處理的翠冠梨枝條嫁接后二叉枝數均為0，30、40和50 Gy處理的二叉枝數占總枝數的比例分別為15.35%、19.47%、40.32%；CK、20和50 Gy處理的翠冠梨枝條嫁接后的三叉枝數均為0，30和40 Gy處理的二叉枝數占總枝數的比例分別為23.79%和9.73%。CK玉露香梨枝條嫁接后的二叉枝數量為0，20、30、40、50 Gy處理后的二叉枝數占總枝數的比例分別為3.97%、5.24%、7.76%、8.73%；CK、20、40和50 Gy處理玉露香梨枝條嫁接后的三叉枝數均為0，30 Gy處理玉露香梨枝條嫁接后的三叉枝數占總枝數的比例為1.51%。說明輻射處理導致梨枝條發生了變異，且不同輻射劑量及不同品種的生物損傷效應存在差異。

由圖1、圖2可知，60Co-γ射線輻射使梨枝條和葉片形態出現畸形葉，如兩尖葉(圖1-B)、皺葉(圖1-C、D)、黃化葉(圖1-E)、半葉(圖1-F)、桃形葉(圖1-G～I)等。部分正常枝分離為二叉枝(圖2-B)，甚至多叉枝(圖2-C)。

2.2 60Co-γ輻射處理梨葉片SPAD值的變化

通過對不同誘變處理的枝條長出的新葉片的SPAD值進行主成分分析，在翠冠梨葉片SPAD值中，第1和第2主成分方差貢獻率分別為28.58%和16.50%，累計方差貢獻率達到45.08%。CK與不同輻射處理組翠冠梨沿著PCA1坐標軸分開，表明誘變處理對翠冠梨產生了較明顯的變異效果(圖3-A)；在玉露香梨葉片SPAD值中，第1主成分、第2主成分方差貢獻率分別為33.12%和15.06%，累計方差貢獻率達到48.18%。玉露香梨CK與40 Gy處理沿著PCA1坐標軸分開，與20 Gy處理沿著PCA2坐標軸分開，而其他處理與CK堆積在一起，表明20 Gy和40 Gy處理對玉露香梨葉片影響較大(圖3-F)。

表1 輻射處理對枝條嫁接成活率以及枝梢形態的影響Table 1 Effects of radiation treatment on the survival rate and shoot shape of grafting shoots

注：A: 正常葉；B～I: 畸形葉。Note: A: Normal leaf. B-I: Deformed leaf.圖1 輻照處理對新生葉片形態變化的影響Fig.1 Effects of radiation treatments on morphological changes of new leaves

注：A：正常枝；B：二叉枝；C：多叉枝。Note: A: Normal branch. B: Binary branch. C: Multi branch.圖2 輻射處理對新生枝條形態變化的影響Fig.2 Effects of radiation treatments on the morphological changes of new branches

為進一步了解誘變處理對梨葉片葉綠素影響，將CK和不同輻射處理分別進行偏最小二乘判別分析。在翠冠梨所有處理中，PLS1和PLS2總貢獻率達到了61.91%～77.16%，該貢獻率較高，可代表所有變異量，且CK和輻射處理組均沿著PLS1分開，進一步說明輻射處理對翠冠梨影響較大(圖3-B、C、D、E)。在玉露香梨所有處理中，PLS1和PLS2總貢獻率達到70.98%～78.76%，該貢獻率較高，可代表所有變異量。其中CK與20和40 Gy 2個處理沿著PLS1分開，進一步說明這2個處理對玉露香梨影響較大(圖3-G、H、I、J)。

2.3 梨葉片病害樣品病原菌分離鑒定

由圖4可知，經過輻射處理的玉露香梨枝條的葉片病害較嚴重(枯死，病部有霉層)，而枝條無明顯病害癥狀(圖4-A、B)。為明確病害類型，對疑似病害樣品進行菌株分離鑒定。通過組織分離法從染病葉片中分離到2種菌落形態的疑似真菌病原物，分別命名為JP-1與JP-2。JP-1與JP-2的菌落早期形態類似，菌絲生長較快，菌落呈白色，氣生菌絲呈絨毛狀；2 d 后JP-2菌落中圈形成明顯的黑色孢子層，而JP-1菌落仍為白色的絨毛狀(圖4-C、D)。

利用NCBI Blast對2個菌株ITS序列比對分析，發現JP-1為炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides), JP-2為黑曲霉(Aspergillusniger)(圖5)。結合ITS結果與葉片典型癥狀，確定該病原菌是炭疽病引起的，而黑曲霉為樣品中的腐生菌，非致病菌，說明誘變會誘發一些致病因子導致玉露香梨葉片感染炭疽病。

注：A、B：病害葉片；C： JP-1；D：JP-2。Note: A、B: Disease leaf. C: JP-1. D: JP-2.圖4 玉露香梨葉片病害樣品形態以及病原菌分離Fig.4 Isolation and identification of pathogens from pear leaf diseases treated

3 討論

肖鑫麗等[26]研究表明在不同果樹種類、品種和不同研究條件下進行輻射誘變，輻射效果存在差異。大量研究表明，果樹中的香蕉[27]、蘋果[28-29]、梨[30]、獼猴桃[31]、龍眼[32]，蔬菜中的生姜[33]、黃瓜[34]、番茄[35]、莧菜[36]，花卉中的冬鳳蘭[37]、蝴蝶蘭[38]、紫薇[39]和黃牡丹[40]，草本植物中的鈍葉酸模[41]等植株成活率均隨著輻射劑量的增加而降低。輻射誘變引起植株性狀改變的原因主要有：一是，輻射誘變引起染色體畸變、堿基替換等遺傳物質的突變；二是，RNA、蛋白質的生物合成受到抑制，生長素及酶等生理活性物質的代謝受到破壞，進而影響個體表型；三是，輻照導致植物體內某些基因處于“打開”或者“關閉”的狀態，進而影響該基因的活躍程度及強度[5, 42]。

本研究中，翠冠和玉露香梨休眠枝條成活率降低可能是因為60Co-γ輻射誘導休眠枝上的芽突變，同時導致芽體的頂端分生組織受到破壞，從而影響了嫁接成活率。而玉露香梨葉片易受炭疽病病菌侵害，可能是由于60Co-γ射線輻射啟動了玉露香梨葉片體內的炭疽病致病相關基因，使該基因處于開啟狀態，表達強度加強，或者抑制了自身的炭疽病抗病相關基因，使該基因處于關閉狀態，表達強度減弱，從而表現出感染炭疽病的表觀性狀。

目前根據梨種質資源的地域、品質特性以及遺傳特點，將其栽培品種分為五大類，即白梨、砂梨、秋子梨、新疆梨和西洋梨[43]。翠冠屬于砂梨類[44]，而玉露香梨屬于白梨類[45]。本研究所有輻射處理均對翠冠梨產生了較大的影響，而20和40 Gy 2個處理對玉露香梨影響較大。這可能是由于2種梨栽培區域、遺傳背景差距較大，導致其對輻射的響應存在差異。閆海霞等[46]研究表明低劑量的60Co-γ輻射會使月季種子的發芽率提高，這可能由于輻射引起種子內部生物自由基或有關酶活性變化，從而提高了種子新陳代謝，促進了種子萌發。

半致死劑量通常被認為是適宜的輻射劑量，更容易獲得有效的誘變效果[47]。如富士嫩枝和嘎啦蘋果休眠枝條60Co-γ輻射半致死劑量分別為30[28]和60 Gy[29]，碭山酥梨休眠枝條[14]和火龍果無菌苗[48]60Co-γ輻射半致死劑量均為40 Gy，獼猴桃枝條60Co-γ輻射半致死劑量為50.6～71.7 Gy[31]。本研究中，最高劑量50 Gy處理翠冠和玉露香梨枝條致死率分別為33.33%、40.00%，說明在翠冠和玉露香梨枝條中半致死劑量應該高于50 Gy，這與庫爾勒香梨輻射研究結果一致[49]。本研究僅提供了輻射當代數據，且劑量選擇偏小，未達到半致死劑量，下一步研究將提高輻射劑量，進一步分析輻射劑量對梨枝條的生物損傷效應。

4 結論

本研究通過60Co-γ射線輻射處理翠冠和玉露香梨枝條發現，枝條嫁接成活率隨輻射劑量的增加而降低，輻射處理導致梨枝條和葉片變異，且不同輻射劑量處理及不同品種響應輻射變異的生物損傷效應存在差異。此外，本研究還發現經過誘變處理的玉露香梨葉片易受炭疽病病菌侵害，梨枝條物理誘變育種適宜的輻射劑量高于50 Gy。該研究結果為60Co-γ射線輻射誘變技術在梨上的應用提供了一定的理論依據。