玉米初級三體的鑒定及傳遞率研究

秦 燕 余水情 趙永康 楊克誠 唐祈林,*

(1 四川農業大學玉米研究所，四川 成都 611130；2 成都市農林科學院作物研究所，四川 成都 611130；3 宜賓市屏山縣人才交流開發服務中心，四川 宜賓 645350)

初級三體的超數染色體是一個正常染色體，配子的染色體數為n，其初級三體就有n種類型。初級三體材料是進行基因定位和連鎖圖譜構建的基礎材料，利用三體分析可以將基因、分子標記和連鎖群定位到特定染色體上[1]。目前已在玉米[2]、水稻[3]、番茄[4]、曼陀羅[5]、大豆[6]、谷子[7]、菜薹[8]、棉花[9]、結球甘藍[10]、普通蕎麥[11]等多種作物中選育出成套或部分三體，并利用三體遺傳分析將水稻香氣基因[12]、水稻光敏核不育基因[13]、大豆rps-1k基因[14]、谷子雄性核不育基因[15]、谷子胚乳糯性基因[16]、谷子矮桿基因[17]、大白菜雄性核不育基因[18]定位到了相應的染色體上。關于三體的形態學和細胞學鑒定，Blackslee等[5]首次從曼陀羅中分離出自然發生的初級三體，并根據曼陀羅的蒴果形態對三體進行了分類。Mcclintock[2]研究表明，玉米的10個初級三體植株雖然較其對應的二倍體植株弱小，但三體與二倍體間差異較小；張成合等[10]對合成的一整套結球甘藍三體進行了形態學和細胞學鑒定，結果表明初級三體在株高、株型、葉形、花蕾大小、開花期等方面表現出一定的差異。申書興等[19]和張成合等[20]分別對大白菜和結球甘藍的初級三體n+1配子傳遞率進行研究，表明多數n+1配子可以通過雌雄配子傳遞，且不同植物和不同染色體的傳遞率不同。目前雖已有關于玉米初級三體的報道，但不同來源的初級三體形態特征及傳遞率的差異較大，而關于玉米初級三體細胞學、形態學鑒定及傳遞率的研究尚鮮見報道。本研究以引進的玉米初級三體為試驗材料，對其初級三體進行形態學、細胞學鑒定及傳遞率研究，以期為玉米初級三體后期應用奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為從美國引進的一套玉米初級三體Trisomic1～Trisomic10(T1～T10)，三體染色體數目為2n+1=21,二倍體染色體數目為2n=20，各三體對應的二倍體簡寫為T1(2n)～T10(2n)。每個三體材料含有1個標記基因，具體信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 染色體計數方法 2016年8月秋將引進的玉米初級三體在云南元江進行自交繁種，2017年3月將繁殖的三體分批發芽，單株編號取根，采用根尖染色體計數法[21-22]鑒定染色體數目。為保證種子發芽率和染色體數目鑒定的準確性，將種子浸泡6 h，在發芽盒中鋪細沙放入培養箱中27℃催芽，待根長至1～1.5 cm時，取根尖，用飽和α-溴萘溶液預處理3 h，再用新鮮固定液[甲醇∶冰乙酸=3∶1(v/v)]固定2～3 h。用2%纖維素酶與1%果膠酶混合(體積比為1∶1)于37℃酶解2.5～3 h，滴加適量改良品紅染液、壓片，在OLYMPUS BX41相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)下鑒定染色體數目。

1.2.2 核型分析方法 核型分析采用李懋學等[23]確定的標準進行，染色體的相對長度、臂比及類型按Levan等[24]的命名系統，染色體相對長度系數采用Kuo等[25]的方法，核型分類參照Stebbins[26]的標準進行計算。用Image-ProPlus5.51(Media Cybernetics, Inc.)專業圖像分析軟件進行染色體長度的測量及染色體核型的配對分析。分別選取5個典型的中期細胞進行測量，取平均值制成染色體參數表，并選擇具有代表性的分裂相排成核型圖。

1.2.3 形態調查方法 鑒定染色體數后，對10個材料中的三體(2n+1)與二倍體(2n)分別進行形態學調查，包括株高、穗位高、雄穗特性(分枝數、穗長)，雌穗特性(粒色、軸色、穗長、穗行數、行粒數、百粒重)，葉片特性(葉片總數、穗三葉葉長、葉寬)，花粉育性(花粉可染率)，花粉育性采用碘染法[27]進行鑒定。

1.2.4 傳遞率及結實率統計 10個玉米初級三體染色體數目鑒定后，2017年配置初級三體自交及其與二倍體的正反交組合：T(2n+1)×T(2n+1)、T(2n+1)×T(2n)、T(2n)×T(2n+1)。2018年統計所得組合的結實數并將每個組合的籽粒逐一進行染色數目鑒定，按照公式計算結實率和額外染色體的傳遞率：

結實率=結實的籽粒數/(行數×行粒數)×100%

(1)

傳遞率=三體株數/鑒定總株數×100%

(2)。

1.3 數據統計與分析

10個玉米材料的三體與二倍體個體各調查5株，用 DPS 7.05 軟件對各材料內三體及其對應的二倍體間的差異顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 染色體數及核型

對10個玉米材料共計1 386個單株進行染色體數目鑒定，由表2可知，10個玉米材料中均有染色體數為2n+1=21的三體出現，且不同材料出現三體頻率存在差異，10個材料三體出現頻率均值為15.6%，變幅為3.4%～25.0%。

由圖1可知，T1～T10增加的1條染色體的形態及染色體相對長度(relative chromosome length，RL)、臂比(arm ratio，AR)，著絲粒位置(position of centromere，PC)等參數均分別與其第1～第10對染色體接近，表明T1～T10是增加玉米第1～第10條染色體的玉米初級三體。由表3可知，其核型主要由中部著絲點染色體(metacentric chromosome，m)和近中部著絲點染色體(submetacentric chromosome，sm)組成，第6號染色體具有隨體，無B染色，體核型類型均屬于較對稱的B型。

表2 玉米單株的三體頻率Table 2 The frequency of trisomics in the single plant of maize

表3 玉米初級三體的核型參數Table 3 Karyotype parameters of maize primary triromics

圖1 玉米三體(T1～T10)核型圖與染色體形態Fig.1 Chromosome morphology and karyogram of maize trisomics (T1-T10)

2.2 形態學鑒定

由表4可知，在玉米植株形態上，除T3外，其余9個三體的株高、穗位高、葉片數、葉長、葉寬均低于對應的二倍體植株，但僅T1的葉長與T1(2n)的差異達到極顯著，其余三體與其對應二倍體間差異均不顯著；在雌穗性狀上，10個三體的雌穗長度、穗行數、行粒數及百粒重均小于對應的二倍體，其中T6雌穗長度與T6(2n)差異達到極顯著；在雄穗性狀上，10個三體的雄穗長度、雄穗分枝數及花粉可染率(花粉育性)均小于對應的二倍體，其中T3、T5、T6、T7、T9的花粉育性與其對應的二倍體之間的差異均達到極顯著水平。綜上表明，除T3的植株較二倍體高外，其余三體的各性狀均較二倍體小，即附加1條染色體導致三體的生活力及生長勢大多弱于其二倍體；而各三體與二倍體間的差異也隨附加的染色體不同而存在差異，附加的染色體不同，對各性狀的影響也不同。t檢測結果表明，T1可通過測量葉片長度對三體植株進行初步鑒定，T3、T5、T7、T9可通過花粉育性檢測對三體植株進行初步鑒定，T6可通過雌穗長度、育性檢測對三體植株進行初步鑒定。

對10個材料中易觀察的標記基因表現型進行觀察，結果表明，T1和T1(2n)中均有黃銅色籽粒出現；T4和T4(2n)均有皺縮籽粒出現；T8和T8(2n)均出現幼苗黃白，成株后緩慢變綠現象；T9和T9(2n)均有糯質玉米出現；T10和T10(2n)籽粒表面均有紫色斑塊出現。綜上，植株標記基因的性狀表現與該植株是否為三體沒有必然聯系。

2.3 初級三體的傳遞率和結實率

由表5可知，10個自交材料的初級三體的結實率為41.3%～55.7%，平均結實率為50.3%，額外染色體傳遞率為3.4%～25.0%，平均傳遞率為15.6%，表明，初級三體自交能夠結實，額外染色體能夠通過自交傳遞。初級三體T1、T2、T4、T5、T6、T9作母本與二倍體雜交材料的結實率為52.7%～69.1%(T3、T7、T8、T10與二倍體正交組合未配置成功)，平均結實率為61.3%，額外染色體傳遞率為1.7%～21.7%，平均傳遞率為9.4%，表明初級三體與二倍體正交均能結實，且結實率高于自交組配方式，但額外染色體的傳遞率卻較自交組配方式下降了6.2個百分點；初級三體作父本與二倍體雜交材料結實率為72.9%～83.4%，平均結實率為78.4%，額外染色體傳遞率為0～6%，有4個三體的傳遞率為0，平均傳遞率為1.8%，表明初級三體作父本與二倍體雜交雖然結實率最高，但額外染色體傳遞率明顯下降，通過二倍體花粉傳遞超數染色體的概率較小。綜上，通過初級三體自交這種方式來進行三體額外染色體的傳遞，能夠達到較高的額外染體傳遞率和適中的結實率。

表4 玉米三體與二倍體各性狀均值及t檢驗結果Table 4 The mean value and t test results of morphological characters between the trisomic and diploid of maize

注*和**分別表示在0.05和0.01水平上顯著。
Note:*and**indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.

注：()中為三體株數/鑒定總株數，“-”表示未收集到數據。
Note：()means number of 2n+1 plant/number of identified plant. ‘-’Indicates that no data had been collected。

3 討論

初級三體的鑒定是三體利用的基礎，鑒定初級三體主要通過形態學鑒定、有絲分裂染色體核型分析、粗線期核型分析、染色體分帶核型分析、分子標記鑒定等方法[28]。研究表明，對初級三體染色體進行識別鑒定最直接的方法是有絲分裂染色體核型分析，但由于最初獲得三體的作物是小染色體物種，利用有絲分裂較難區分，有研究者進一步應用粗線期的染色體進行核型分析[29]，目前已有應用分子標記對水稻[30]、大白菜[31]等作物進行初級三體鑒定的報道，但該分析方法鑒定結果易受環境因素干擾。本研究結果表明，部分玉米初級三體與其二倍體的一些性狀間差異達到顯著水平，從理論上說，可以通過差異顯著的性狀對三體進行鑒定，但由于形態學性狀受環境、氣候等自然條件影響較大，鑒定結果可信度較低。因此在三體鑒定中，形態學鑒定不能作為最可靠的鑒定手段，需與細胞學鑒定或分子標記鑒定結合。

本研究中，除T3的株高、穗位高及雄穗長度略高于對應的二倍體植株外，其余9個三體各性狀均小于對應的二倍體，這與Mcclintock[2]的研究結果一致，其原因為三體增加一條額外染色體，可能會導致其生活力及生長勢都弱于二倍體植株，對于T3材料出現的異常現象的原因尚不明確。此外，初級三體系植株標記基因的性狀表現與植株是否為三體沒有必然聯系，可利用分子標記等手段對初級三體標記基因的表達進一步深入研究。

額外染色體的傳遞率是利用三體進行遺傳分析的重要參數。一般通過(2n+1)×2n、2n×(2n+1)這2種組配模式來測定額外染色體的傳遞率。申書興等[19]研究發現大白菜額外染色體通過雌配子傳遞率為8.69%～29.42%，通過雄配子傳遞率為3.53%～23.53%；張成合等[20]發現結球甘藍額外染色體通過雌配子傳遞率為5.36%～42.37%，通過雄配子傳遞率為1.54%～13.04%；羅雙霞等[1]發現芥藍額外染色體通過雌配子傳遞率為10.15%～27.63%，通過雄配子傳遞率為4.91%～11.86%，即額外染色體通過雌配子傳遞率一般高于雄配子的傳遞率。本研究增加了(2n+1)× (2n+1)三體自交模式測定傳遞率，該模式傳遞率為3.4%～25.0%，高于僅通過雌配子(1.7%～21.7%)和僅通過雄配子(0～6.0%)的傳遞率，表明通過玉米初級三體自交可獲得更高的傳遞率，其原因可能是雌、雄配子同時出現n+1配子，從而增加了2n+1個體出現的幾率。

4 結論

本研究結果驗證了T1～T10確實是分別增加玉米第1～第10條染色體的玉米初級三體；玉米初級三體的鑒定可采用細胞學和形態學鑒定相結合方法；額外染色體通過三體自交的傳遞率為3.4%～25.0%，高于僅通過雌配子(1.7%～21.7%)和僅通過雄配子(0～6.0%)的傳遞率，通過自交對該初級三體系的額外染色體進行傳遞，能夠達到較高的傳遞率和適中的結實率。對引進的初級三體進行細胞學、形態學鑒定及傳遞率研究為該套初級三體的進一步利用提供了應用基礎，具有十分重要的意義。下一步可利用該套玉米初級三體進行相關基因定位研究、染色體或基因的重復效應研究等。