荷斯坦牛DRA基因多態性及序列特征分析

劉麗霞 張 麗,* 歐陽霞輝 喬自林 付保強

(1 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030； 2 西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030)

牛(Bostaurus)的主要相容性復合體即牛的白細胞抗原(bovine lymphocyte antigen, BoLA)是一組緊密連鎖的高度多態基因家族，編碼主要組織相容性抗原，與機體的免疫應答和抗病性具有密切的相關性，位于牛的第23號染色體上，由Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因構成[1-3]。牛DRA基因位于BoLA-Ⅱ類基因的Ⅱa亞區，編碼DR分子的α鏈，參與抗原呈遞和傳輸過程[4]，與人DRA基因的結構非常相似[5]，牛的DRA基因可在牛晚期黃體的內皮細胞中高表達[6]。與α鏈上的其他基因相比，DRA基因的多態性較低[7]，早期研究認為該基因僅有1個等位基因，是1個單態基因。隨后研究者發現牛的DRA基因座位上也存在等位變異，Sigurdardottir等[8]最早報道了5個DRA的RFLP分型；Sena等[9]發現水牛包含2個DRA等位基因，其中1個位于抗原結合位點上，且該基因在不同的品種中具有不同的特征；王興平[10]在秦川牛、魯西牛、南陽牛和晉南牛的DRA外顯子2的第116和第197位分別發現G→A和T→C的點突變，且該基因對南陽牛的體高標記效應顯著；中國荷斯坦牛、中國西門塔爾牛和三河牛中具有3個DRA外顯子2的等位基因，其基因型與乳房炎的易感性和抗性有關[11]；甘南牦牛和天祝白牦牛DRA外顯子2具有3個單核苷酸多態位點(single nucleotide polymorphism sites, SNPs)，具有較為保守的多態性[12]；而李彥清等[13]在天祝白牦牛、大通牦牛、甘南牦牛和普通牛的DRA第2外顯子上檢測到197位的T>C和116位的G>A突變；Sun等[14]發現大額牛及其雜交后代DRA基因的核苷酸和氨基酸序列與普通牛和牦牛的相似度達到99%；張周等[15]在大通牦牛和天祝白牦牛DRA外顯子上分別檢測到2個堿基突變位點；付保強等[16]發現荷斯坦牛DRA外顯子1上有1個堿基插入。由此可見，牛DRA基因具有一定的多態性，但這種多態性具有高度的保守性。

從分子水平上了解基因的基本結構和生物學功能，可為研究其作為疾病相關候選基因奠定理論基礎。近年來國內外已有關于牛DRA基因特性和結構功能的相關研究報道[17-21]，但有關荷斯坦牛DRA基因序列特征的相關研究尚未見報道。

本研究利用荷斯坦牛基因組DNA混合池擴增并直接測序的方法對DRA基因編碼區(coding regions, CDS)進行多態性分析，同時利用生物信息學方法預測DRA基因的理化特性及其編碼蛋白的高級結構，以期為荷斯坦牛的疾病相關基因篩選和抗病分子育種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究從寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司采集303頭荷斯坦牛尾靜脈血液各10 mL，低溫保存，帶回實驗室后立即-20℃冷凍保存。采用傳統的酚-氯仿抽提法[22]提取血液基因組DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank數據庫中牛的DRA基因序列(登錄號：AJ505000和M30120)，利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設計DRA基因4對引物(表1)，分別擴增4個外顯子序列和部分內含子序列，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 DRA基因引物信息表Table 1 DNA primers of DRA gene

1.2.2 基因組DNA混合池構建和PCR擴增 選取擴增效果良好的荷斯坦牛DNA樣品237個，每50個樣品構建1個DNA混合池，以混合池DNA為模板進行擴增。PCR擴增反應體系總體積20 μL，包括混合DNA 1 μL、2×PowerTaqPCR MasterMix(百泰克公司，北京)11 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、滅菌超純水7 μL。擴增反應程序：94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(不同引物溫度詳見表1)30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72 ℃終延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的擴增效果。

1.2.3 序列測定與比對DRA基因4個外顯子的PCR擴增產物由江蘇金唯智生物科技有限公司進行純化后雙向測序，采用Editseq軟件檢查測序峰圖，利用MEGA6.0軟件比對4個外顯子序列，并進行拼接獲得DRA基因編碼區序列。

1.2.4 序列特征分析 對DRA基因編碼區序列特征進行分析用到的工具包括：Expasy服務器上的ProtParam工具和Protscale程序；CBS的NetNGlyc和NetPhos在線軟件；PredictProtein服務器；SWISS-MODEL同源建模構建蛋白質三級結構模型并繪制PyMOL軟件視圖。

2 結果與分析

2.1 荷斯坦牛DRA基因4個外顯子擴增結果

由圖1可知，PCR擴增產物電泳條帶特異性良好，條帶清晰，DRA基因4個外顯子片段大小均與預期擴增片段相符。

注：M：DL 2 000 DNA maker；泳道1，2：DRA外顯子1； 泳道3，4：DRA外顯子2；泳道5，6：DRA外顯子3；泳道7，8：DRA外顯子4。Note: M:DL 2 000 DNA maker. Lane 1,2:DRA exon1. Lane 3,4: DRA exon2. Lane 5,6:DRA exon3. Lane 7,8: DRA exon4.圖1 荷斯坦牛DRA基因PCR擴增產物Fig.1 The PCR amplicons of DRA gene in Holstein cattle

注：方框內為外顯子2序列。Note: The sequence of exon2 is showed in the box.圖2 荷斯坦牛DRA基因編碼區核苷酸序列與參考序列比對結果Fig.2 Alignment of the nucleotide sequences of DRA coding regions identified from Holstein cattle and reference sequence from Genbank

2.2 荷斯坦牛DRA基因編碼區序列比對

荷斯坦牛DRA基因CDS區序列全長762 bp，與GenBank中牛的DRA基因序列(AJ505000和M30120)進行比對，結果發現荷斯坦牛DRA基因CDS區共有4個堿基突變(圖2)，均位于外顯子2上，分別為 c.161A>T、c.195G>A、c.276C>T和c.312C>A，其中第161位的A>T突變為錯義突變，導致第54位氨基酸由谷氨酸(E)變為纈氨酸(Ⅴ)，其余均為同義突變。

2.3 序列特征分析

2.3.1 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的理化特性和親/疏水性 利用ProtParam工具預測荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的理化特性和組成，結果顯示，荷斯坦牛DRA基因共編碼253個氨基酸，氨基酸組成中亮氨酸比例最高，占所有氨基酸組成的10.30%，而半胱氨酸比例最低(1.20%)(表2、圖3)。采用Protscale程序預測荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的親/疏水性，結果表明，多肽鏈的第227位疏水性最強，評分為3.43，第103位親水性最強，評分為-2.52(圖4)。整條氨基酸肽鏈的親水和疏水氨基酸分別占53.47%和46.53%，總平均親水性為0.09。

圖3 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸組成預測Fig.3 Putative amino acid composition of DRA gene in Holstein cattle

注：正值表示疏水；負值表示親水。Note: Positive means hydrophobicity.Negative means hydropathicity.圖4 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的親水性/疏水性預測Fig.4 Prediction of hydropathicity/hydrophobicity of amino acids encoded by DRA gene in Holstein cattle

2.3.2 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的N-糖基化位點和磷酸化位點 NetNGlyc和NetPhos在線軟件預測結果顯示，荷斯坦牛DRA基因編碼的氨基酸無潛在的N-糖基化位點，有15個潛在的磷酸化位點(表3)。

2.3.3 荷斯坦牛DRA蛋白質的二級結構和三級結構 PredictProtein預測結果顯示，荷斯坦牛DRA蛋白二級結構組分中α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲所占比例分別為18.97%、30.04%、7.51%和43.48%，其中無規則卷曲是荷斯坦牛DRA蛋白二級結構中的主要元件。利用SWISS-MODEL同源建模構建DRA蛋白三級結構模型并繪制PyMOL軟件視圖(圖5)。

表3 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的磷酸化位點Table 3 Phosphorylation sites of amino acids encoded by DRA gene in Holstein cattle

圖5 荷斯坦牛DRA蛋白三級結構模型預測Fig.5 Tertiary structure of DRA protein for Holstein cattle

3 討論

MHC基因在抗原特異性適應免疫反應中起著重要作用[23]。牛的DRA基因編碼牛MHCⅡ類抗原分子的α鏈，該基因外顯子2編碼的抗原結合區在抗原識別與呈遞中發揮著重要作用[24]。研究表明，豬DRA基因與腹瀉之間存在顯著的相關性[25-26]，牛DRA外顯子2與牛乳房炎的抗性和易感性有關[27-29]。因此，對動物DRA基因多態性和結構功能的研究是進一步研究該基因作為動物抗病相關候選基因可能性的基礎。

基因的多態性與動物的生產性狀間存在一定的相關性[30]，對動物基因多態性的研究是探究其與生產性能間關系的基礎。本研究中，荷斯坦牛DRA基因編碼區具有4個核苷酸突變位點，包含1個錯義突變和3個同義突變，比其他品種牛的突變位點多，但c.195G>A和c.276C>T位點在各牛種中均存在[11-14]，表明荷斯坦牛DRA基因的多態性較為豐富，同時牛DRA基因在品種間表現出高度的保守性。

對基因特性的分析可揭示其在機體中可能發揮的作用[31]。荷斯坦牛DRA基因共編碼253個氨基酸，根據其理論等電點(<7)和不穩定指數(<40)推斷，該蛋白為酸性且穩定蛋白[32]，胞內蛋白的穩定性直接影響著生命活動和細胞周期。蛋白質的疏水性對其穩定性、構象和功能具有一定的影響[33]，荷斯坦牛DRA蛋白總平均疏水性大于0，由此推斷荷斯坦牛DRA蛋白為不可溶蛋白，與南陽牛一致，而與犏牛不同[34]。蛋白質糖基化主要修飾天冬酰胺上的N端，影響免疫分子的結構和功能，進一步影響機體對抗原的應答反應[33,35]，而磷酸化可以調節蛋白質在信號轉導中的作用，從而對細胞生長、分化以及基因表達造成一定的影響[36]，荷斯坦牛DRA蛋白無潛在的N-糖基化位點，而存在15個潛在的磷酸化位點，這表明DRA基因對荷斯坦牛的抗原免疫應答影響不大，但可能通過影響其他基因的表達、病毒的信號轉導或者細胞的代謝從而改變機體的抗病能力。

蛋白質二級結構是指多肽鏈依賴氫鍵排列成具有周期性結構的構象，是氨基酸序列和三維構象之間的橋梁，對其進行預測和分析有助于認識蛋白的空間結構，進而了解蛋白的功能[26]。荷斯坦牛DRA蛋白二級結構為混合型(Hh<45%，Ee>20%)[37]，該蛋白中較大比例的無規卷曲(43.48%)可能影響蛋白質肽鏈中配體和受體的結合，進而影響生物學功能。

4 結論

本研究利用基因組DNA混合池擴增并直接測序的方法獲得荷斯坦牛DRA基因編碼區序列并對其特征進行分析，結果表明，荷斯坦牛DRA基因編碼區上僅有4個堿基突變，多態性較低。荷斯坦牛DRA基因共編碼253個氨基酸，其編碼產物是一種酸性且穩定的不可溶蛋白，具有15個潛在的磷酸化位點；二級結構為混合型，其中無規則卷曲所占的比例最高；三級結構由α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲組成。本研究結果為深入研究荷斯坦牛DRA基因分子結構和功能奠定了一定的理論基礎。