超高效液相色譜快速測定糧食中黃曲霉毒素含量

□ 司鴻銀 宜賓市糧油質量監測站

當前糧食檢驗中常用的檢測方法有以下幾種：①薄層色譜法；②膠體金試紙條法；③酶聯免疫法；④液相色譜法或液質聯用法。不同方法的實驗操作流程和所需實驗器材各不相同，且薄層色譜法的操作手法過于復雜，一般很少采用，而膠體金法和酶聯免疫法適用于急速篩查實驗[1]。基于此，為了獲取準確的數據，本次實驗采用超高效液相色譜方法。

1 實驗設備與測量方法

1.1 儀器與材料

在黃曲霉毒素免疫親和柱的型號選擇上，選擇國內制造經驗豐富的華安麥科公司。采用美國waters公司生產的超高效液相色譜儀以及英國Whatman公司生產制造的纖維濾紙。除此之外，還采用了由華安麥科公司生產的6位泵流操作架以及梅特勒生產的型號為ME802的電子分析天平。材料選擇如下：美國Millipore公司專用實驗用超純水，華安麥科公司制備的純度為99%的黃曲霉素標準品，美國Fisher公司生產的可在純色譜下進行檢驗的甲醇。

1.2 分析條件

為了得到精確的檢驗結果，對實驗分析條件作出如下限制：①色譜柱設置為C18色譜柱50mm×3mm，1.7 μm，30 ℃；②甲醇和水的配比設置在45∶55；③流動相流速設置0.3mL/min；④進樣本體積設置為2 μL；⑤色譜柱波長設為360nm，Em：440 nm。

1.3 樣品制備方法

首先，將沒有感染黃曲霉菌（AF）的稻谷、小麥、玉米這三種樣品用高速旋轉粉碎機進行粉碎，直到其顆粒小于0.5mm時進行過篩稱重。各取得質量等于25.0g的樣品，將其放入容量等于250mL的三角瓶中，加入黃曲霉素混合溶液，使得稻谷、小麥、玉米中的AFB的含量等于51g和20g，保障霉菌毒素的濃度配比等于B1∶B2∶G1∶G2為4∶1∶4∶1，將其避光保存，溫度設 置為室溫。然后，對過夜儲存后的小麥等谷物樣品注入水比濃度為80∶2的氯 化鈉和甲醇溶液，將混合有該溶液的樣品放置在高速均質器中3～5 min后提取2 mL，然后用定量濾紙和玻璃纖維濾紙進行過濾，直到溶液變清，等待下一步凈化。最后，將黃曲霉素免疫親和柱和直徑為10 mL的玻璃注射器連接，用玻璃注射器迅速滴取2 mL之前經過過濾的混合液，然后將空氣壓力泵和玻璃注射器相連接，確保混合液可以以每秒1滴的速度進入免疫親和柱內，此時要確保柱，流速約為每秒1～2滴，直至空氣進入親和柱中[2]。

2 實驗結果與分析

2.1 激發波長、發射波長的選擇

在背景溶液的選擇上，采取流動相，需用熒光檢測器對黃曲霉素標準液以190～600 nm進行掃描，掃描后得出以下結果：①AFB140．0g/L；②AFB210．0g/L；③AFG140．0g/L；④AFG210．0g/L。由此結果可知，標號為B1和G1的黃曲霉毒素經過超高效液相色譜測試后，所反映出來的熒光信號較為明顯，所以這兩類黃曲霉素菌需要經過精密實驗也可以進行檢測，其靈敏度較高，和普通液相檢測體系存在差異。導致這類差異產生主要原因在于超高效液相色譜測試系統中對樣品顆粒大小有著嚴苛的要求，樣品顆粒越小，其柱效以及色譜峰寬也就越明顯，這樣一方面可以保障實驗樣品的分離度，另一方面也可以提高樣品的靈敏度。

2.2 流動相的優化

黃曲霉毒素作為一種極性化合物，其流動相多采用水基溶液，一般多采用甲醇與水，乙腈與水這兩種溶液作為備選溶液參與實驗，經過對色譜分離效果的檢驗。

經過實驗可知，流動相優化后的保留時間可以長達6 min，改時間正好和黃曲霉素的出峰時間相對應。此時可以計算出每消耗一個樣品所需的甲醇量，計算公式如下：0.2 mL/min（流速）×3 min（保留時間）×0．4（有機溶劑配比）=0．336 mL。目前常用液相色譜方法的流動相通常為乙腈、甲醇和水，配比分別為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶27∶65，20∶30∶60或20∶30∶50，流速為0．8～1 mL/min，最后出峰的時間為3 min或更長，測1個樣品需6．9～11．6 mL有機相（甲醇和乙腈），與之相比，本方法有機溶劑用量大大減少，更為環保。

2.3 方法的線性范圍與檢出限

經過以上色譜條件可檢測出AFB1、AFG1、AFB2和 AFG2的系列標準溶液，設置超高效液相色譜的峰面積為縱坐標，用y表示，其質量為橫坐標用x表示，根據實驗數值繪制標準曲線，同理，根據該曲線可以得出3倍信噪比的峰響應值，根據10倍信噪比的峰響應值，得出線性范圍的下限，結果見表1。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程及檢出限

3 實驗結論

本文用超高液相色譜該方法，分析來自不同地區的30種糧食樣品（大米、小麥、玉米）的黃曲霉毒素，并且僅一種玉米樣品被污染。AFB1含量為0.4 ng/g，AFB2含量為0.922 ng/g。高通量和低溶劑檢測樣品，適用于快速定量測定食品中的黃曲霉毒素。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限確定為0.15、0.05、0.40、0 .06 pg，黃曲霉毒素在0.4～60.0 pg，0.2～15.0 pg，1.5～60.0 pg和0.2～15.0 pg的范圍是線性相關的，相關系數R2為0.999 9；0.999 9；0.999 8和0.999 2；小麥、玉米和大米加標樣品的回收率為77.4%～104.2%，精 密 度為 1.8%～8.9%。該方法還可用于谷物中四種黃曲霉毒素的測定，無需衍生化，適用于食品中黃曲霉毒素的快速定量測定。

4 結語

經過上述精密的實驗和分析，最終得出采用超高效液相色譜可以在無需衍生的條件下測量糧食中的黃曲霉素含量，這一方法無疑是食品檢驗界的一大進步，一方面突破了原有的技術壁壘，另一方面也為食品安全提供了保障。