QuECHERS方法檢測動物源性食品中15種喹諾酮類藥物殘留量及風險監測研究

□ 宋曉婉 梁先龍 馮 娟 宋旭鳳 姚 凱 安徽中青檢驗檢測有限公司

1 前言

喹諾酮類藥物（quinolones）是人工合成的具有抗菌作用的一類藥物，因其無交叉耐藥性以及價格低廉等優點而被廣泛應用于臨床醫學和動物醫學領域。由于在預防和治療過程中喹諾酮類藥物的不規范使用，濫用及盲目改變使用劑量常有發生，影響到食物的食用安全，由此導致的食品安全問題備受關注[1-2]。據國內現有的檢驗標準和相關文獻報道，主要研究方法有液相色譜法[3]、液相色譜-質譜法[4]，其中液相色譜-質譜法作為主要研究方法[5,6]，解決了液相檢出限高、靈敏度低、基質干擾嚴重等問題。但是，前處理方法也多采用固相萃取技術[7]，需要經過凈化濃縮等步驟，成本較大、費時費力，靈敏度和重復性差，針對以上問題，本文在實驗過程中，研究的重點主要集中在待測物提取和凈化步驟的改進，得到了具有低試劑消耗及高通量優勢的QuECHERs方法，同時建立HPLC-MS/MS測定方法，此次研究取得的相應進展也將有助于殘留篩查，為喹諾酮類藥物的應急檢測及風險監測提供技術支撐。

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

吡哌酸、依諾沙星、氟羅沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、西諾沙星、奧索利酸、萘啶酸與氟甲喹的標準物質均購自上海安譜科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸 均為色譜純，德國Merck公司；封端十八烷基（C18）粉末、N-丙基乙二胺（PSA）粉末，山東青云公司；無水硫酸鎂、氯化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。1290-6470三重四級桿液質聯用儀，美國 Agilent 公司；TGL-16M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；超純水系統，四川優普公司；G560E渦旋混勻器，上海佳能；MD200-1氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；十萬分之一、萬分之一電子天平，德國賽多利斯公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品前處理

準確稱取粉碎均勻的樣品2 g，置于50 mL離心管中，向樣品中加入混合外標，禽畜肉及水產樣品中先加入2 mL水，渦旋使樣品分散均勻，然后向每個管中加入10 mL 5%的甲酸乙腈溶液，渦旋1 min，向各個管中加入萃取鹽（4 g MgSO4，1 g NaCl），渦旋振蕩3 min后，4 ℃下于高速冷凍離心機中以8 000 rpm的速度離心3 min。取上層乙腈層6 mL轉移至15 mL凈化管（含有50 mg PSA、150 mg C18、和900 mg MgSO4）中，渦旋2 min，以5 000 r/min的速度離心5 min，將全部上清液轉移至另一試管中，氮吹儀吹干，用1 mL初始流動相復溶，然后再用高速離心機以10 000 r/min的速度離心10 min，取上層溶液過0.22 μm有機相濾膜，上機。

2.2.2 色譜條件

2.2.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱溫：30℃，進樣量：2 μL；流動相：A0.1%甲酸水；B乙腈。梯度洗脫，B流動相：0～1.0min 20%，1.0～4.0 min 25%，4～ 8.5 min：95%，8.5～12 min：10%。

2.2.2.2 液相色譜-串聯質譜條件

質譜條件：ESI源，多反應監測模式（MRM），霧化氣電壓：40 psi，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：11 L/min，鞘流氣溫度400 ℃，鞘流氣流速11 L/min；毛細管電壓：4 000 V。各喹諾酮類化合物的定量和定性離子、去簇電壓和碰撞能量各參數參考國家標準。

2.2.3 實驗過程

用空白基質配制混合標準溶液系列，以各個化合物濃度為橫坐標，色譜圖峰面積為縱坐標做標準曲線。從標準曲線對應的最低濃度點取混合標準溶液,加入陰性樣品中進行加標實驗，逐步調整各目標化合物的加標量，直到測出3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比時對應的樣品濃度，分別計算對應化合物的方法檢出限和定量限。分別取雞肉、雞蛋、魚肉的空白基質，進行批內6平行，添加2.0、5.0、10.0 μg/kg 3個水平的15種喹諾酮類藥物混合標準溶液，按2.2.1方法進行添加回收實驗。

3 結果與討論

3.1 線性關系、檢出限、定量限和回收率

為降低基質效應影響，提高定量結果的準確性，本研究采用了空白基質提取液作為溶劑的標準曲線溶液，結果表明15種喹諾酮類化合物在相應濃度范圍內線性良好（R2≥0.995 3），該方法的檢出限在0.11～ 0.85 μg/kg，定量限在0.38～1.55 μg/kg，15種喹諾酮類藥物的色譜圖如圖1所示。

3.2 樣品的加標回收率與精密度

取樣品，分別加入3個不同濃度水平的標準溶液，實驗步驟按2.2進行。每個添加水平重復測定6次，回收率在80.5%～112.8%，RSD為0.5%～12.0%。

3.3 實際樣品的測定結果

圖1 15 種喹諾酮類藥物的MRM色譜圖

隨機購買市售畜副產品、水產品100組，藥物殘留檢出率為15.4%，其中雞蛋中恩諾沙星和環丙沙星的含量較低，均低于定量限，魚類產品檢出恩諾沙星、氧氟沙星，最大濃度分別為85.6 μg/kg和34.5 μg/kg，雞肉中主要檢出恩諾沙星，最大濃度45.6 μg/kg。結果數據分析表明目前畜副產品及水產品種的檢出值低于國家限值要求[8]，但也需要加強管理，規避風險，保證食品安全。

4 結論

本實驗建立了同時測定動物源性食品中15種喹諾酮類藥物的液相色譜-串聯質譜的檢測方法。禽畜肉及水產樣品中要首先加水進行分散，然后采用含5%甲酸的乙腈提取，無水硫酸鎂-氯化鈉萃取，PSA和C18凈化。液相色譜采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，乙腈和0.1%甲酸水溶液作流動相進行梯度洗脫。質譜分析采用電噴霧多反應監測模式，采用基質混合標準曲線外標法定量。1種喹諾酮類藥物在各自的濃度范圍內線性良好，線性相關系數（R2）均大于0.995 0，以雞肉、雞蛋、魚肉為代表性基質進行3水平加標回收實驗，回收率為80.5%～112.8%，相對標準偏差（RSD）在0.5%～12.0%。本方法簡便快速，靈敏度和準確性高，應用于日常檢測可以縮短檢測周期，降低檢測成本，對于喹諾酮類藥物殘留檢測具有重要意義。