直擊生命大分子過招中的力與美

張佳星

酶與底物的過招可追溯千萬年，卻始終無從參透。近日，施一公研究團(tuán)隊(duì)分別在《自然》和《科學(xué)》上發(fā)表文章，報(bào)道了人源γ-分泌酶識(shí)別兩種不同底物的高分辨率結(jié)構(gòu)，繼報(bào)道γ-分泌酶蛋白本身的結(jié)構(gòu)之后，更進(jìn)一步還原生命物質(zhì)間的“過招故事”。

冰封王座，一片瑩藍(lán)。

兩名柔術(shù)高手的過招被定格在鏡面般的冰層中。一束電子射來，擊打在冰雕表面，它們彈跳開的軌跡將被高靈敏的感光元件捕獲，上萬倍地放大影像呈現(xiàn)出生命蛋白糾纏的力與美。

“酶與底物的相互作用短短一瞬，就好像剪刀剪斷繩子的剎那，我們要探知的是這個(gè)瞬間的結(jié)構(gòu)和機(jī)理。”文章第一作者、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后楊光輝表示，人源γ-分泌酶不僅是阿爾茲海默氏癥（俗稱老年癡呆癥）發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素之一，還“執(zhí)掌”著生長、發(fā)育相關(guān)的Notch信號(hào)蛋白的切割工作，稍有差錯(cuò)可能誘發(fā)腫瘤。

曙光出現(xiàn)在“半胱氨酸交聯(lián)”上

冷凍電鏡的發(fā)明，讓人們可以直觀地“看到”微小的蛋白分子，而要看到它們的相互作用，卻并不容易。這就好比拍照時(shí)的靜態(tài)和抓拍，前者隨時(shí)可以“咔嚓”，后者卻講究個(gè)時(shí)機(jī)。

而酶與底物相互靠近到“過招”再到分離（結(jié)合—酶切—解離），是高度動(dòng)態(tài)的過程，這意味著抓拍的時(shí)機(jī)極難獲得。

“我們?cè)嚵撕芏喾椒ǎ@得酶與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)難度非常大。”楊光輝說，“這也是為什么蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析經(jīng)常需要數(shù)年探索。”

曙光出現(xiàn)在一種被稱為“半胱氨酸交聯(lián)”的方法上。這個(gè)復(fù)雜的名詞在生活中卻十分常見，例如燙頭發(fā)過程中就發(fā)生了半胱氨酸交聯(lián)，卷發(fā)后半胱氨酸交聯(lián)在一起固定發(fā)型。它的原理是，在氧化劑存在的條件下，蛋白質(zhì)中距離足夠近的兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵，從而交聯(lián)在一起。

在博士期間從事過半胱氨酸交聯(lián)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，讓楊光輝對(duì)這一方法十分熟悉，他在與導(dǎo)師溝通實(shí)驗(yàn)進(jìn)展時(shí)討論并提出了這個(gè)方法，希望能帶來轉(zhuǎn)機(jī)。“科研是一個(gè)厚積薄發(fā)的過程，前面學(xué)習(xí)到的很多東西，很可能有某一種是攻克其他重要課題時(shí)用得到的。”楊光輝始終記得老師施一公的指導(dǎo)，在大量的文獻(xiàn)中學(xué)習(xí)積累、獨(dú)立思考，才能在遇到難題時(shí)，找到正確的思路。

引入突變完成結(jié)對(duì)“擺拍”

半胱氨酸交聯(lián)的難題是，在哪里進(jìn)行修飾、引入突變。早老素（γ-分泌酶的核心組分）有467個(gè)氨基酸，底物有100個(gè)氨基酸，如果全部試一遍將是天文數(shù)字。“突變引入的位置不恰當(dāng)，除了可能根本連接不上之外，還可能使得蛋白本身不表達(dá)，或者使得蛋白的性質(zhì)、功能等發(fā)生改變。”楊光輝說，在做之前雖然很難說有幾成把握，但是過往的積累和思考能夠幫助探索加速。

在謎底揭開前，他們并不知道酶和底物“過招”時(shí)哪個(gè)部分離得最近。“由于2013年時(shí)，我們?cè)@得了γ-分泌酶的三維結(jié)構(gòu)，因此對(duì)這個(gè)酶有一定的了解。”楊光輝說，團(tuán)隊(duì)選擇了柔性最強(qiáng)的區(qū)域。因?yàn)槊冈谶M(jìn)行作用時(shí)肯定要發(fā)生構(gòu)象變化，柔性意味著這里是可能的變化區(qū)域。

楊光輝還對(duì)該區(qū)域進(jìn)行了精細(xì)到序列位點(diǎn)的分析，一定程度上預(yù)估了酶與底物作用時(shí)可能發(fā)生什么。通過綜合考慮多種信息，最終，團(tuán)隊(duì)在酶和底物上分別先挑選了4個(gè)位點(diǎn)，以16種組合進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)基因上的點(diǎn)稍作修飾，讓部分區(qū)域的氨基酸分子表達(dá)為半胱氨酸，在氧化環(huán)境下，二硫鍵的吸引力讓二者的結(jié)合成為可能，復(fù)合物也就“擺拍”成型了。就這樣通過讓蛋白質(zhì)與底物換各種“擺拍”方式，蛋白質(zhì)電泳在大小正確的位置上終于有了像模像樣的條帶。“那是2017年的冬天，我們終于獲得了復(fù)合物。”楊光輝說，難以置信和興奮異常結(jié)伴而來，讓他連著幾天也沒能睡好，畢竟，γ-分泌酶與其底物都是跨膜蛋白，獲得它們的穩(wěn)定復(fù)合物是世界級(jí)難題。

“不能盲目相信它就是了，雖然蛋白分子大小與期望中的復(fù)合物一致，但也要反復(fù)求證。”楊光輝說，這是后面實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，如果不對(duì)這一步“較真”，后面的實(shí)驗(yàn)是有風(fēng)險(xiǎn)的。

根據(jù)分子量的初步判斷，就好像從兩個(gè)人的體重分辨。為了在真身顯露（上冷凍電鏡）之前，再多加幾成把握，團(tuán)隊(duì)從不同的角度開始驗(yàn)證。

“既然二硫鍵是在氧化條件下形成的，那么在還原條件下就應(yīng)該能夠解開，分別變成單體。”楊光輝說，實(shí)驗(yàn)證明了他們的猜想，變成單體之后的分子量也與早老素和底物的大小一致。

隨后，團(tuán)隊(duì)還通過免疫印跡、質(zhì)譜鑒定等方法分別對(duì)自己苦苦追尋到的復(fù)合物進(jìn)行考察，最終每一個(gè)結(jié)果都成功地為復(fù)合物“加了分”。

高分辨率結(jié)構(gòu)揭開復(fù)合物謎團(tuán)

施一公團(tuán)隊(duì)完成了對(duì)γ-分泌酶與底物Notch的復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析，分辨率高達(dá)2.7埃（1埃等于0.1納米），這是第一個(gè)γ-分泌酶與底物復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，也是第一個(gè)膜內(nèi)蛋白水解酶與底物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。利用相似的策略，團(tuán)隊(duì)順利獲得了γ-分泌酶與另一個(gè)重要底物淀粉樣前體蛋白（APP）的穩(wěn)定復(fù)合物，并獲得了其冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

在冷凍電鏡的高分辨率結(jié)構(gòu)中，一切細(xì)節(jié)被數(shù)萬倍放大，相互作用的謎團(tuán)也被一一揭曉。回過頭看時(shí)，身為發(fā)現(xiàn)者，楊光輝也對(duì)生命機(jī)理的奇妙感到驚喜：“所謂眼見為實(shí)，真的是親眼見到才敢相信酶和底物是這么作用的。”

“γ-分泌酶是一個(gè)跨膜蛋白，因?yàn)榧?xì)胞膜的主要成分是磷脂，上面的蛋白應(yīng)該是親脂不親水的，而它對(duì)底物的切割卻需要水解，這是一個(gè)矛盾。”楊光輝進(jìn)一步解釋，酶卻可以處理得很好。結(jié)構(gòu)顯示，在跨膜區(qū)靠近細(xì)胞內(nèi)的一側(cè)，早老素通過構(gòu)象變化，與底物的胞內(nèi)段形成穩(wěn)定的β-sheet結(jié)構(gòu)，為穩(wěn)定底物提供了保證。底物被酶變化出的新結(jié)構(gòu)β-sheet“錨定”住，同時(shí)“解旋”。原先被隱藏在“腹中”的“弱點(diǎn)”一下暴露出來，只等酶切。也正因?yàn)榻庑淖饔茫H水的基團(tuán)得以出頭，推動(dòng)酶的水解工作完成。這一結(jié)構(gòu)觀察第一次直觀證明了長久以來膜內(nèi)蛋白水解酶酶切底物時(shí)，底物蛋白需要發(fā)生解旋的猜想。此外，根據(jù)得到的結(jié)構(gòu)，研究組提出了γ-分泌酶結(jié)合底物并依次進(jìn)行多步酶切的機(jī)理：底物的跨膜螺旋隨著切割的進(jìn)行逐步解旋，并與γ-分泌酶形成新的中間態(tài)復(fù)合物再次進(jìn)行切割。

近年來，多數(shù)治療阿爾茨海默癥的方法是通過抑制γ-分泌酶的活性來減少淀粉樣沉淀的，然而由于γ-分泌酶的“一酶多功能”，單純地對(duì)其抑制甚至可能會(huì)抑制對(duì)Notch的切割，增加患上腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。精細(xì)地分析酶對(duì)不同底物關(guān)鍵作用位點(diǎn)的功能，將可能研發(fā)特異性抑制APP的切割而不影響Notch切割的藥物。