直擊生命大分子過招中的力與美

張佳星

酶與底物的過招可追溯千萬年，卻始終無從參透。近日，施一公研究團隊分別在《自然》和《科學》上發表文章，報道了人源γ-分泌酶識別兩種不同底物的高分辨率結構，繼報道γ-分泌酶蛋白本身的結構之后，更進一步還原生命物質間的“過招故事”。

冰封王座，一片瑩藍。

兩名柔術高手的過招被定格在鏡面般的冰層中。一束電子射來，擊打在冰雕表面，它們彈跳開的軌跡將被高靈敏的感光元件捕獲，上萬倍地放大影像呈現出生命蛋白糾纏的力與美。

“酶與底物的相互作用短短一瞬，就好像剪刀剪斷繩子的剎那，我們要探知的是這個瞬間的結構和機理。”文章第一作者、清華大學生命科學學院博士后楊光輝表示，人源γ-分泌酶不僅是阿爾茲海默氏癥（俗稱老年癡呆癥）發病過程中的關鍵因素之一，還“執掌”著生長、發育相關的Notch信號蛋白的切割工作，稍有差錯可能誘發腫瘤。

曙光出現在“半胱氨酸交聯”上

冷凍電鏡的發明，讓人們可以直觀地“看到”微小的蛋白分子，而要看到它們的相互作用，卻并不容易。這就好比拍照時的靜態和抓拍，前者隨時可以“咔嚓”，后者卻講究個時機。

而酶與底物相互靠近到“過招”再到分離（結合—酶切—解離），是高度動態的過程，這意味著抓拍的時機極難獲得。

“我們試了很多方法，但獲得酶與底物的復合物結構難度非常大。”楊光輝說，“這也是為什么蛋白質復合物結構的解析經常需要數年探索。”

曙光出現在一種被稱為“半胱氨酸交聯”的方法上。這個復雜的名詞在生活中卻十分常見，例如燙頭發過程中就發生了半胱氨酸交聯，卷發后半胱氨酸交聯在一起固定發型。它的原理是，在氧化劑存在的條件下，蛋白質中距離足夠近的兩個半胱氨酸形成二硫鍵，從而交聯在一起。

在博士期間從事過半胱氨酸交聯的相關實驗，讓楊光輝對這一方法十分熟悉，他在與導師溝通實驗進展時討論并提出了這個方法，希望能帶來轉機。“科研是一個厚積薄發的過程，前面學習到的很多東西，很可能有某一種是攻克其他重要課題時用得到的。”楊光輝始終記得老師施一公的指導，在大量的文獻中學習積累、獨立思考，才能在遇到難題時，找到正確的思路。

引入突變完成結對“擺拍”

半胱氨酸交聯的難題是，在哪里進行修飾、引入突變。早老素（γ-分泌酶的核心組分）有467個氨基酸，底物有100個氨基酸，如果全部試一遍將是天文數字。“突變引入的位置不恰當，除了可能根本連接不上之外，還可能使得蛋白本身不表達，或者使得蛋白的性質、功能等發生改變。”楊光輝說，在做之前雖然很難說有幾成把握，但是過往的積累和思考能夠幫助探索加速。

在謎底揭開前，他們并不知道酶和底物“過招”時哪個部分離得最近。“由于2013年時，我們曾獲得了γ-分泌酶的三維結構，因此對這個酶有一定的了解。”楊光輝說，團隊選擇了柔性最強的區域。因為酶在進行作用時肯定要發生構象變化，柔性意味著這里是可能的變化區域。

楊光輝還對該區域進行了精細到序列位點的分析，一定程度上預估了酶與底物作用時可能發生什么。通過綜合考慮多種信息，最終，團隊在酶和底物上分別先挑選了4個位點，以16種組合進行試驗，對基因上的點稍作修飾，讓部分區域的氨基酸分子表達為半胱氨酸，在氧化環境下，二硫鍵的吸引力讓二者的結合成為可能，復合物也就“擺拍”成型了。就這樣通過讓蛋白質與底物換各種“擺拍”方式，蛋白質電泳在大小正確的位置上終于有了像模像樣的條帶。“那是2017年的冬天，我們終于獲得了復合物。”楊光輝說，難以置信和興奮異常結伴而來，讓他連著幾天也沒能睡好，畢竟，γ-分泌酶與其底物都是跨膜蛋白，獲得它們的穩定復合物是世界級難題。

“不能盲目相信它就是了，雖然蛋白分子大小與期望中的復合物一致，但也要反復求證。”楊光輝說，這是后面實驗的基礎，如果不對這一步“較真”，后面的實驗是有風險的。

根據分子量的初步判斷，就好像從兩個人的體重分辨。為了在真身顯露（上冷凍電鏡）之前，再多加幾成把握，團隊從不同的角度開始驗證。

“既然二硫鍵是在氧化條件下形成的，那么在還原條件下就應該能夠解開，分別變成單體。”楊光輝說，實驗證明了他們的猜想，變成單體之后的分子量也與早老素和底物的大小一致。

隨后，團隊還通過免疫印跡、質譜鑒定等方法分別對自己苦苦追尋到的復合物進行考察，最終每一個結果都成功地為復合物“加了分”。

高分辨率結構揭開復合物謎團

施一公團隊完成了對γ-分泌酶與底物Notch的復合物結構解析，分辨率高達2.7埃（1埃等于0.1納米），這是第一個γ-分泌酶與底物復合物的高分辨率結構，也是第一個膜內蛋白水解酶與底物的復合物結構。利用相似的策略，團隊順利獲得了γ-分泌酶與另一個重要底物淀粉樣前體蛋白（APP）的穩定復合物，并獲得了其冷凍電鏡結構。

在冷凍電鏡的高分辨率結構中，一切細節被數萬倍放大，相互作用的謎團也被一一揭曉。回過頭看時，身為發現者，楊光輝也對生命機理的奇妙感到驚喜：“所謂眼見為實，真的是親眼見到才敢相信酶和底物是這么作用的。”

“γ-分泌酶是一個跨膜蛋白，因為細胞膜的主要成分是磷脂，上面的蛋白應該是親脂不親水的，而它對底物的切割卻需要水解，這是一個矛盾。”楊光輝進一步解釋，酶卻可以處理得很好。結構顯示，在跨膜區靠近細胞內的一側，早老素通過構象變化，與底物的胞內段形成穩定的β-sheet結構，為穩定底物提供了保證。底物被酶變化出的新結構β-sheet“錨定”住，同時“解旋”。原先被隱藏在“腹中”的“弱點”一下暴露出來，只等酶切。也正因為解旋的作用，親水的基團得以出頭，推動酶的水解工作完成。這一結構觀察第一次直觀證明了長久以來膜內蛋白水解酶酶切底物時，底物蛋白需要發生解旋的猜想。此外，根據得到的結構，研究組提出了γ-分泌酶結合底物并依次進行多步酶切的機理：底物的跨膜螺旋隨著切割的進行逐步解旋，并與γ-分泌酶形成新的中間態復合物再次進行切割。

近年來，多數治療阿爾茨海默癥的方法是通過抑制γ-分泌酶的活性來減少淀粉樣沉淀的，然而由于γ-分泌酶的“一酶多功能”，單純地對其抑制甚至可能會抑制對Notch的切割，增加患上腫瘤的風險。精細地分析酶對不同底物關鍵作用位點的功能，將可能研發特異性抑制APP的切割而不影響Notch切割的藥物。