西北地區4種優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵性能研究

張霞,李妙善,周恩光,王虎成

(蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020)

近年來，我國反芻家畜養殖業發展迅速，40%～80%的粗飼料被用于反芻動物飼糧中，提供給宿主動物和瘤胃微生物重要的營養物質[1-2]， 其次，苜蓿(Medicagosativa)、燕麥(Avenasativa)、飼用玉米(Zeamays)等優質飼草是我國建植栽培草地、也是黃土高原丘陵溝壑區進行飼草生產的主要資源，亦是反芻動物養殖的主要粗飼料；同時，充分利用優質飼草(玉米、燕麥、苜蓿青貯等)作為飼草資源，將有助于緩解草畜矛盾、充分利用非常規飼草資源，利用不同飼草的組合來改善進入反芻動物體內的營養平衡，加強我國特別是西北地區飼草資源合理利用，促進畜牧業的高效發展。然而，優質粗飼料相對而言存在較大的缺口。因此，如何更好地利用與提高研究區優質粗飼料的利用率被廣泛關注。目前評定飼料營養價值的主要方法包括體內法、半體內法和體外法，其體外瘤胃發酵法因其方法簡便、經濟、快速而被廣泛用于評定飼料的營養價值[3-5]。據報道，韓肖敏等[6]用體外產氣法評價玉米秸稈、稻草(Oryzasativa)、玉米秸稈青貯與精料的組合效應，結果表明60%玉米秸稈+40%稻草、24%玉米秸稈+16%稻草+60%玉米秸稈青貯、9.6%玉米秸稈+6.4%稻草+24%玉米秸稈青貯+60%精料為最優組合；張建勛等[7]研究飼糧精粗比對南江黃羊瘤胃體外發酵的影響結果表明高精料飼糧對南江黃羊體外發酵有顯著的影響；孫國強等[8]利用體外瘤胃發酵法研究全株玉米青貯與花生蔓(Arachishypogaea)和羊草(Leymuschinensis)間的組合效應，結果表明全株玉米青貯與花生蔓比例為70: 30的組合、全株玉米青貯-花生蔓-羊草比例為56∶24∶20的組合具有最大組合效應；張吉鹍等[9]對稻草與多水平苜蓿混合瘤胃體外發酵組合效應的整體研究，結果表明稻草與苜蓿適宜添補量為40%～60%；李妍等[10]對體外法評價玉米秸稈、谷草和玉米秸稈青貯飼料組合效應的研究，結果表明玉米秸稈和谷草的搭配比例為60∶40，玉米秸稈、谷草、玉米秸稈青貯飼料的搭配比例為12∶8∶80為最優組合；孟梅娟等[11]對小麥(Triticumaestivum)秸稈與米糠粕瘤胃體外發酵組合效應研究表明小麥秸稈與米糠粕的最優組合是75∶25；并且對相關氮源水平、半胱胺、植物精油、沙柳(Salixcheilophila)、苧麻(Boehmerianivea)等的體外瘤胃發酵特性和飼用價值研究報道較多[12-16]；綜合以上研究進展，前人研究主要集中在利用體外瘤胃發酵法對秸稈、稻草、谷草、羊草類等粗飼料，不同精粗比以及一些添加劑的研究、開發和利用。但以玉米、燕麥、苜蓿裹包青貯及苜蓿干草這4種優質粗飼料飼用價值和適宜配合比例尚未見系統研究報道。為此，本研究選用黃土高原丘陵溝壑區推廣應用的玉米、燕麥、苜蓿裹包青貯及苜蓿干草為試驗材料，利用體外產氣法評價單一飼草及不同組合的肉牛瘤胃發酵性能及組合效應，旨在為該研究區幾種優質飼草的飼用價值及合理搭配做初步探究，為正確進行肉牛日糧中粗飼料搭配積累數據和提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用飼草為玉米、苜蓿、燕麥裹包青貯，均購自甘肅民祥牧草有限公司，苜蓿干草以及供體動物飼用精料均有由養殖場提供，采集的鮮樣經凍干機凍干制成粉樣，干草直接制成粉樣，備作常規化學成分分析與體外產氣試驗，飼草營養成分如表1所示。

表1 飼草營養成分Table 1 Nutrients of 4 kinds of forage (干物質基礎dry matter basis, %)

1.2 試驗設計

采用單因子重復試驗設計，將4種優質飼草按干物質組成7種不同比例組合：組合1(50%玉米青貯+50%燕麥青貯，C1)、組合2(50%玉米青貯+50%苜蓿青貯，C2)、組合3(80%玉米青貯+20%苜蓿干草，C3)、組合4(50%燕麥青貯+50%苜蓿干草，C4)、組合5(70%玉米青貯+10%燕麥青貯+20%苜蓿青貯，C5)、組合6(65%玉米青貯+15%燕麥青貯+25%苜蓿青貯，C6)、組合7(50%玉米青貯+20%燕麥青貯+30%苜蓿青貯，C7)，共構成11種發酵底物。

1.3 試驗用瘤胃液供體動物

試驗于2017年9月在甘肅省定西市甲天下肉牛養殖場進行。選取3頭健康狀況良好，體重約600 kg的西門塔爾牛作為瘤胃液供體動物。試驗期間肉牛拴系飼養，保持圈內清潔干燥，定期進行消毒。全混合飼糧(total mixed rations, TMR)日飼喂2次(早上7:30和下午16:00)，采食后自由飲水。

1.4 體外發酵

體外發酵試驗參照Menke等[17]推薦的方法進行。在晨飼前，用瘤胃液采集器(科立博A1164K)經口腔采集3只肉牛的瘤胃液共1 L，迅速裝入充滿CO2的密閉容器并保溫39 ℃盡快帶回實驗室。把取得的瘤胃液經4層紗布過濾，得到濾液，并與人工唾液以體積比1∶2混合，39 ℃恒溫，同時通入無氧CO2，得到人工瘤胃液。然后將其置于39 ℃磁力攪拌器上不斷攪拌，同時通入CO2氣泡(需通入底部)，直至溶液顏色變為無色，呈還原狀態，在液面以上持續通入CO2確保厭氧。準確稱量試驗飼料0.4000 g于已裝入10 g左右玻璃珠的尼龍袋(0.048 mm)中，封口后置入100 mL刻度玻璃注射器中；將40 mL混合液迅速注入裝樣注射器,密封、排氣后于(39.0±0.5) ℃水浴搖床連續培養48 h，每個樣3個重復；同一批次設定3個空白對照。

1.5 測定指標及方法

1.5.1產氣量及產氣動力學 分別在培養3、6、9、12、24、36、48 h記錄每個注射器活塞的位置并讀數，以計算各時間點的產氣量(gas production, GP)。計算公式為：

某時間點的GP=該段時間樣品GP-該段時間空白樣GP

根據?rskov等[18]的產氣模型，將各種樣品在3、6、9、12、24、36、48 h時的產氣量代入下列公式計算各部分產氣量。

GP=a+b(l-exp-ct)

式中：GP，t時間的產氣量(mL·g-1)；a，快速降解部分產氣(mL·g-1)；b，慢速降解部分產氣量(mL·g-1)；c，產氣速率(%·h-1)；a+b，潛在產氣量(mL·g-1)。

1.5.2干物質消失率(dry matter disappearance, DMD) 在體外48 h發酵結束后，迅速放置冷水中終止發酵,將已編號并稱重的尼龍布用蒸餾水沖洗數次直至干凈，然后將尼龍布小心無損的轉移到烘箱中以105 ℃烘24 h至恒重，計算干物質消失率。

飼料干物質消失率=[樣本干物質量-消化后殘渣干物質量]×100%/樣本干物質量

1.5.3體外發酵參數 培養48 h后，用SX-620型酸度計測定培養液pH值；采用苯酚-次氯酸鈉顯色法測定氨態氮(NH3-N)濃度，具體程序參照周建偉[19]的方法；揮發性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)濃度參照李曉亞[20]的方法，使用Agilent-6890A型氣相色譜儀測定。

1.5.4組合效應指數的計算 參照王旭[21]所使用的方法計算指標的單項組合效應指數(single factors associative effects index, SFAEI)與多項組合效應指數(multiply factors associative effects index, MFAEI)，具體公式如下：

SFAEI=(組合后實測值-加權估算值)/加權估算值
MFAEI=∑單項組合效應值

式中：加權估算值=某種飼料的實際測定值×所占比例+另一種飼料的實際測定值×所占比例。

1.6 數據分析

數據經Excel 2010初步處理后，使用SPSS 20.0軟件的一般線性模型進行方差分析，分別對4種單一原料和7種組合飼料進行Duncan氏多重比較；用非線性回歸參數估計程序求出產氣動力學參數；結果用“平均值±標準誤”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 優質飼草的肉牛瘤胃體外發酵產氣性能

隨培養時間的延長，各組產氣量逐漸上升，其中發酵初期增長速度較快(表2)。4種單一飼料在各時間點的GP玉米青貯最高，苜蓿青貯最低(P<0.05)，其中48 h的GP，玉米青貯比其他3種分別提高了29.15%(燕麥青貯)、66.17%(苜蓿青貯)和38.04%(苜蓿干草)。7種組合在各時間點產氣特點為，C3的GP最高，C4最低(P<0.05)，其中C3比其他各組合分別提高了24.07%(C1)、30.12%(C2)、39.08%(C4)、12.81%(C5)、22.57%(C6)和25.52%(C7)，且其他各組合間亦存在顯著差異(P<0.05)。

4種單一飼料的慢速降解部分產氣量和潛在產氣量依玉米青貯、燕麥青貯、苜蓿青貯、苜蓿干草的次序降低，且存在顯著差異(P<0.05)(表3)；快速降解部分產氣量和產氣速率常數分別為玉米青貯(-9.47 mL·g-1)和苜蓿干草(0.04%·h-1)最高，與其他單一飼料存在顯著性差異(P<0.05)。7種組合中的快速降解部分產氣量和產氣速率常數均以C2最高，分別為-17.56 mL·g-1和0.07 %·h-1；慢速降解部分產氣量和潛在產氣量均以C3最高，分別為167.69和165.00 mL·g-1，均顯著高于其他組合(P<0.05)。

2.2 優質飼草在肉牛體外瘤胃發酵48 h的DMD與發酵參數

體外發酵48 h后，4種單一飼料中玉米青貯的干物質消失率(DMD)最高(81.73%)，顯著高于其他3種粗飼料(P<0.05)；培養液的pH介于6.27～6.72，苜蓿青貯pH最高，且各組間差異顯著(P<0.05)；NH3-N濃度，燕麥青貯(38.12 mg·dL-1)顯著高于其他3種粗飼料(P<0.05)。7種組合的DMD以C2顯著低于C5和C7(P<0.05)；pH介于6.40～6.69，其中C3顯著低于其他6種(P<0.05)，其中C5和C6最高；NH3-N的濃度C1與C2顯著高于其他5種，其中C7最低(表4)。

表2 優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵產氣量Table 2 In vitro gas production of high-quality forage treated with rumen fluid of beef cattle (mL·g-1)

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference between the treatments(P<0.05), while same letter in the same column indicate not significant difference between the treatments (P>0.05), the same below.

表3 優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵產氣動力學參數Table 3 In vitro gas production kinetic parameters of high-quality forage treated with rumen fluid of beef cattle

注：“-”表示產氣滯后，快速降解部分產氣量大小由絕對值確定。

Note: “-” indicates gas production lag, and partial gas production of rapid degradation is determined by absolute value.

表4 優質飼草在肉牛體外瘤胃發酵48 h的DMD、pH及NH3-N 濃度Table 4 The pH and NH3-N concentration of fermentation fluid and DMD of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

4種單一粗飼料培養48 h后培養液的總揮發性脂肪酸(TVFA)和丁酸濃度均為玉米青貯顯著高于苜蓿青貯和干草(P<0.05)；丙酸濃度玉米青貯顯著高于其他3種，且燕麥青貯顯著高于苜蓿青貯和干草(P<0.05)；乙酸/丙酸(acetic acid/propionic acid, A/P)玉米青貯和燕麥青貯顯著低于其他2種(P<0.05)(表5)。7種組合培養48 h后，培養液的TVFA濃度C2和C4顯著低于C5和C6(P<0.05)；乙酸含量C1顯著低于C2、C4和C7(P<0.05)，且C7最高；丙酸含量C1、C5、C6顯著高于C2、C4、C7(P<0.05)；A/P 值C7顯著高于C1、C3、C5、C6(P<0.05)，且C1最低；丁酸含量C5顯著高于C2、C3、C4、C7(P<0.05)，且C7最低；戊酸含量C7顯著低于其他6組(P<0.05)，且C4最高。

表5 優質飼草在肉牛體外瘤胃發酵48 h的總揮發性脂肪酸構成Table 5 The volatile fatty acid profile of fermentation fluid of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

2.3 優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵48 h的組合效應

GP和乙酸含量只有C1出現負組合效應，其他6種組合均為正組合效應；DMD在C1、C2和C3均為負組合效應，其余4組均為正組合效應，且C4最大(0.2330)；pH在C2和C3時為負組合效應，其余組合間均為正組合效應；NH3-N濃度在各組合均出現負組合效應；丙酸與丁酸含量在各組合均為正組合效應，且均在C4時達到最大，分別為0.4892和0.6008(表6)。所有組合的綜合組合效應均為正效應，由高到低依次為C4、C2、C5、C1、C3、C6、C7。故而，本試驗條件下，C4為最佳組合(50%燕麥青貯+50%苜蓿干草)，C2(50%玉米青貯+50%苜蓿青貯)次之，且玉米青貯、燕麥青貯、苜蓿青貯三者配比以70∶10∶20較優。

表6 不同比例優質飼草的組合效應Table 6 The combination effect of different proportion of high-quality forage treated 48 h in vitro with rumen fluid of beef cattle

3 討論

3.1 優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵產氣性能

飼料在瘤胃中產生的氣體主要來源于微生物對飼料中碳水化合物和蛋白質含碳部分的分解，體外產氣量是反映瘤胃中微生物活性、飼料降解率及飼料總體可發酵程度的指標。其大小取決于可發酵有機物含量和瘤胃微生物活力，產氣量大說明瘤胃微生物的活性高，對底物發酵越充分，若產氣量低，則主要由于底物中可供微生物發酵產物不足所致[17,21-23]。快速降解產氣量和慢速降解產氣量反映飼料發酵前期和后期可降解部分，其值越大表示該階段可發酵成分含量高。研究表明飼料中蛋白質、NDF、ADF等不易發酵成分含量越高,則產氣量越低[24]。通常情況下，易發酵碳水化合物含量高的能量飼料在24 h之內GP就可達到最高峰,蛋白質飼料在48 h內產氣量可達到高峰,但含結構性碳水化合物較多的粗飼料的產氣量最高峰在48 h以后才出現[25]。本研究中的粗飼料為玉米青貯、燕麥青貯、苜蓿青貯和苜蓿干草，其結構性碳水化合物含量相較秸稈等低品質粗飼料較高，各粗飼料的最高GP均在48 h之后出現，且玉米青貯和燕麥青貯的發酵啟動時間短，主要因為禾本科飼料相對豆科飼草含有更多的易發酵碳水化合物。其次，因不同飼料組合，其非結構性碳水化合物與碳水化合物比例及其碳水化合物與蛋白質比例間有所差異，致使在不同比例組合間的產氣規律也有所不同。本試驗中，C4(50%燕麥青貯+50%苜蓿干草)產氣量相對最低，可能是該組合中的ADF和NDF含量相對較高，可供微生物發酵產物不足所致，降低了體外發酵的產氣速率，從而產氣量降低；同時C3(80%玉米青貯+20%苜蓿干草)產氣量相對最高，究其原因可能是該組合玉米青貯含量高，且其含有更多的可發酵碳水化合物，并且CP和ADF含量較低等，有利于微生物發酵，提高其微生物活性，與楊志林等[26]的研究結果一致。

3.2 優質飼草在肉牛體外瘤胃發酵48 h的干物質消失率與發酵參數

飼料DMD是反映其被動物利用程度大小的重要指標，也是表示反芻動物機體消化利用飼料中有機物能力的重要指標，降解率越高，飼料的可利用程度就越高[27]。DM的降解主要是CP、EE和CF等物質的降解[28]，瘤胃碳氮比適中，更有利于微生物活動，亦對應高的DMD。本研究條件下，玉米青貯和燕麥青貯的DMD分別為81.73%、70.53%，相對較高，其玉米青貯的DMD高的原因是青貯后的玉米富含非結構性碳水化合物，可消化的有機物含量高，很容易被瘤胃微生物發酵利用；而燕麥青貯DMD高的原因可能是其碳氮比合適，更易被微生物利用。此外，亦有研究表明較低的飼料粗灰分和ADF含量會對應較高的DMD[29]，故而這也是玉米青貯和燕麥青貯DMD較高的原因之一。其次，C2(50%玉米青貯+50%苜蓿青貯)DMD最低，可能是因為含有較高苜蓿青貯，其非結構性碳水化合物含量低，不易被瘤胃微生物發酵利用。

瘤胃液pH是反映瘤胃內部環境與發酵水平的一項綜合指標，瘤胃pH大小影響瘤胃微生物蛋白合成和微生物區系的穩定性，保證瘤胃正常發酵所需的pH范圍為6～7[30]，其大小由諸多因素共同決定，包括日糧類型、唾液分泌和瘤胃代謝產物等[31]。一般情況，體外發酵培養液pH隨著飼料發酵時間的延長而顯著下降，主要因為發酵產酸增加及累積[32]。本試驗中，雖然pH受粗飼料類型的影響，但4種單一飼料培養液pH (6.27～6.72)和7種組合培養液pH(6.40～6.69)均在適宜范圍內，表明發酵48 h不會影響瘤胃微生物生長繁殖。

瘤胃液中氨態氮(NH3-N)不僅是瘤胃微生物分解含氮物質的產物，也是合成微生物蛋白的主要氮來源[33]。NH3-N濃度為瘤胃微生物合成菌體蛋白提供氮源，最佳NH3-N濃度有利于微生物生長繁殖的環境，若供應不足，則微生物合成受阻，動物生產性能降低，相反，過高則會加重機體氮代謝的負擔[34]。一般情況下，瘤胃氨氮水平處于動態平衡狀態，但瘤胃NH3-N的含量變動很大，其最佳范圍為6.58～36.7 mg·dL-1[35]。Hoover[30]則認為，瘤胃微生物生長適宜氨氮濃度為3.3～8.0 mg·100 mL-1，由于日糧蛋白質及碳水化合物(CHO)發酵的差異，實際上瘤胃液中氨氮的變化幅度多在1～76 mg·100 mL-1，從而影響瘤胃微生物活性。本研究中，4種單一飼料和7種組合飼料的NH3-N濃度變化范圍分別為18.87～38.12 mg·dL-1和5.69～22.53 mg·dL-1，其均在有關文獻報道的范圍內[30,36]，這說明其濃度可以確保瘤胃微生物的正常生長。其次，C6和C7發酵48 h時NH3-N濃度低于微生物發酵的最佳濃度下限。體外發酵體系中NH3-N的主要來源為微生物對底物含氮物質的降解，而生成的NH3-N有2個主要去向，一部分被微生物用來合成微生物蛋白(microbial protein, MCP)，另一部分溶解在發酵液中(發酵瓶不具有吸收和排出NH3-N的能力)。碳水化合物是限制瘤胃微生物利用NH3-N的主要因素。結合產氣量及DMD指標，C6和C7發酵48 h時NH3-N濃度最低的原因可能生成的NH3-N被微生物所利用，與王珊等[37]研究報道相一致。

揮發性脂肪酸(VFA)是反芻動物的主要能量來源，為瘤胃微生物增殖提供主要碳架來源[38-39]，可為反芻動物提供60%～80%的可消化能[40]。揮發性脂肪酸濃度的高低說明了瘤胃中碳水化合物消化率大小[41]，同時，其含量及組成比例是反映瘤胃消化代謝活動的重要指標之一。乙酸作為合成體脂和乳脂的原料，能為動物提供所需的大部分能量；葡萄糖合成的前體物質為丙酸，能量轉化效率均高于其他酸，因此丙酸型發酵能為機體提供生長和生產所需的能量[34]，從而可以進一步提高動物的生產水平和飼料利用率；而丁酸大部分以酮體的形式氧化。VFA濃度及比例的影響因素眾多，有發酵底物結構(如纖維素和半纖維素發酵產生的乙酸比例較高，而淀粉等易發酵的碳水化合物發酵產生的丙酸比例較高[42])和各種微生物菌群的活性。反芻動物瘤胃內乙酸、丙酸、丁酸占總揮發性脂肪酸的比例分別為50%～65%、18%～25%和12%～20%[43]，據此推算，乙酸/丙酸范圍應為2.0～3.6，且其值受到動物、飼料及飼養條件等因素的影響。本試驗中，4種單一飼料和7種組合飼料的VFA的各成分中皆以乙酸的濃度為最高，乙酸、丙酸含量均介于上述范圍的上限或偏高；其中玉米青貯的TVFA最高，A/P最低，表明玉米青貯在瘤胃中消化利用率高，進一步表明禾本科飼料易被消化吸收，與史卉玲等[44]研究結果相一致。

3.3 優質飼草的肉牛體外瘤胃發酵48 h的組合效應

本試驗中不同比例飼草的組合效應指數可以看出，某一項指標的單項組合效應指數并不一定與綜合組合效應指數結果相一致。諸多早期研究結果表明，只有結合多項指標對組合效應結果進行綜合評定，才能從整體水平上得出更為準確、客觀的結論[24,39,42]。此外，韓肖敏等[6]指出，飼料以相對適宜的比例組合后，營養成分間通過互補促進了微生物的生長,有利于促進養分的高效利用。本試驗中各處理的組合效應指數均為正值，其中兩兩組合以C4(50%燕麥青貯+50%苜蓿干草)為最優，三者組合以C5(70%玉米青貯+10%燕麥青貯+20%苜蓿青貯)為最佳，表明合理的飼糧搭配，更有利于動物胃腸道微生態的平衡，近而有利于其對飼料養分的消化利用，相關機理有待進一步研究。

4 結論

本研究條件下，玉米青貯的體外發酵GP、DMD、TVFA及乙酸濃度均最高，發酵速度快；苜蓿青貯的體外發酵GP較低，發酵速度慢。各處理的組合效應由高到低依次為：50%燕麥青貯+50%苜蓿干草，50%玉米青貯+50%苜蓿青貯，70%玉米青貯+10%燕麥青貯+20%苜蓿青貯，50%玉米青貯+50%燕麥青貯，80%玉米青貯+20%苜蓿干草，65%玉米青貯+15%燕麥青貯+25%苜蓿青貯，50%玉米青貯+20%燕麥青貯+30%苜蓿青貯。