IL-12和TGF-β1在非急性硬膜下血腫內(nèi)的表達及血腫形成時間推斷中的法醫(yī)學意義

杜 宇，任 鵬，單 迪，賈儒林

（中國刑事警察學院 法醫(yī)系，遼寧 沈陽110035）

硬膜下血腫（subdural hematoma，SDH）是法醫(yī)學鑒定工作中常見的顱內(nèi)血腫，多由外傷造成。根據(jù)臨床起病緩急分為急性、亞急性及慢性，傷后3 d至3周出現(xiàn)癥狀者為亞急性硬膜下血腫，3周以上者為慢性。亞急性和慢性硬膜下血腫（以下統(tǒng)稱為非急性硬膜下血腫）進程緩慢，外傷后經(jīng)歷一段時間才呈現(xiàn)相應癥狀，因此與外傷的關聯(lián)性成為法醫(yī)鑒定的難點問題。目前并無推斷非急性硬膜下血腫形成時間的有效方法。非急性硬膜下血腫的發(fā)病機制尚未形成統(tǒng)一共識，但研究認為，局部炎癥反應，血腫外膜新生血管生成及再出血與非急性硬膜下血腫的發(fā)生發(fā)展關系密切[1-5]。

本研究選擇促炎性細胞因子白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和促進新生血管生成和組織纖維化的轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作為觀察對象，檢測這兩種細胞因子在非急性硬膜下血腫液中的含量變化，探討利用細胞因子推斷硬膜下血腫形成時間的可行性。

1 材料與方法

1.1 對象及分組

選取2014年9月—2016年9月間的非急性硬膜下血腫患者30例，其中男26例，女4例；年齡46～73 歲，平均（64±7.3）歲；23 例有明確外傷史；6例伴有顱骨骨折。

影像學檢查初次發(fā)現(xiàn)血腫時，血腫量估算不超過10 mL，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀無或輕微，依據(jù)臨床癥狀及CT或MRI檢驗結果的變化證實血腫為慢性進程，隨病程發(fā)展，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐漸加重，最終采取局麻下顱骨鉆孔沖洗引流術抽取血腫，術前估算血腫量50～100 mL。初次發(fā)現(xiàn)血腫至神經(jīng)癥狀出現(xiàn)的時間間隔超過3 d，初次發(fā)現(xiàn)血腫至鉆孔沖洗引流術的時間間隔超過7 d，均為單側幕上血腫；患者術前凝血功能正常，未使用影響凝血、纖溶的藥物，術前2月內(nèi)無急慢性感染性疾病史；顱腦以外器官及組織無輕傷（含）以上程度損傷。納入患者的病程最短7 d，最長 64 d，平均（31±7）d。 依據(jù)初次發(fā)現(xiàn)血腫至手術之間時間間隔將病例分為3組（血腫組），A組：7～14 d；B 組：15～21 d；C 組：22 d 以上。

1.2 檢材采集

所有病例均在局麻下行顱骨鉆孔沖洗引流術，術中收集未沖洗前抽出的血腫液10 mL和患者靜脈血3mL備檢。同年齡段的10名志愿者（8男，2女，凝血功能正常，未使用影響凝血、纖溶的藥物，近期無感染性疾病史）分別空腹抽取靜脈血3 mL（健康外周血對照組）。所采靜脈血均置于3.2%枸椽酸鈉抗凝（1：9）真空采血管，離心半徑 4 cm，3 000 r/min，離心10 min，分離得到血清。全部檢材-80℃冰箱低溫保存?zhèn)錂z。

本研究符合患者所在醫(yī)院人體試驗委員會所制定的倫理學標準，得到批準予以實施，并與患者家屬及自愿者簽署實驗知情同意書。

1.3 檢測方法

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血腫液及靜脈血中IL-12和 TGF-β1含量。IL-12 （P40）（h）ELISA kit（武漢博士德生物工程有限公司），TGF-β1 ELISA kit（上海信帆生物科技有限公司），采用意大利SD11/XT-96MB酶標儀，操作均嚴格按照儀器和ELISA檢測試劑盒說明要求進行，繪制標準曲線，計算出IL-12、TGF-β1表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0軟件分析，測定結果用均數(shù)±標準差（±s）表示；采用t檢驗；P＜0.05 視為差異有顯著性。

2 結果

與健康志愿者外周血內(nèi)IL-12、TGF-β1的含量相比較，硬膜下血腫患者的血腫內(nèi)和外周血內(nèi)IL-12、TGF-β1含量均顯著提高。

血腫內(nèi)IL-12含量隨血腫形成時間延長而下降，A組（硬膜下血腫形成7～14 d）最高，B組（硬膜下血腫形成15～21 d）和C組（硬膜下血腫形成22 d以上）逐漸降低，分別是同組患者外周血內(nèi)IL-12含量的 19.5、14.1、11.0 倍，各血腫組之間比較差異顯著（P＜0.01）。血腫患者外周血IL-12含量組間差異不明顯（P＞0.05）。

血腫內(nèi)TGF-β1含量隨血腫形成時間延長而逐漸增加，A組最低，C組最高，分別是同組患者外周血內(nèi) TGF-β1 含量的 21.1、54.8、94.4 倍，各血腫組之間比較差異顯著（P＜0.01）。 血腫患者外周血TGF-β1 含量組間差異不明顯（P＞0.05）。 血腫和靜脈血IL-12和TGF-β1含量變化詳見表1。

表1 非急性硬膜下血腫患者血腫液和外周血內(nèi)IL-12和TGF-β1含量變化x±s

3 討論

非急性硬膜下血腫的發(fā)生與癥狀出現(xiàn)具有一定的時間間隔，因此容易引發(fā)血腫與爭議外傷之間是否存在關聯(lián)的爭議，相關檢案成為法醫(yī)學鑒定的疑難問題。如果能對非急性硬膜下血腫形成時間進行估算將有助于血腫成因的推斷工作。但是，目前尚沒有關于非急性硬膜下血腫形成時間推斷的相關研究。

炎癥反應、新生血管生成和纖維化是損傷發(fā)展過程中必不可少的病理過程。隨著分子生物學發(fā)展，與炎癥反應、新生血管生成、纖維化關系密切的細胞因子越來越多的被應用于損傷時間推斷[6-8]。雖然非急性硬膜下血腫的發(fā)生、發(fā)展機制仍不明確，但局部炎癥反應、血腫外膜新生血管的形成及再出血在解釋血腫發(fā)病機制方面逐漸為人們所接受，與炎癥反應和新生血管生成相關聯(lián)的細胞因子在慢性硬膜下血腫內(nèi)高表達已經(jīng)被證實[3-5，9-12]。炎癥反應和新生血管生成、纖維化分別在損傷后的不同時段占優(yōu)勢，因此我們設想與相應生物學作用密切相關的細胞因子在硬膜下血腫內(nèi)的表達可能呈現(xiàn)規(guī)律性，可作為血腫形成時間推斷的指標。

IL-12是具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的促炎癥性細胞因子，在多種損傷和疾病的炎癥反應階段發(fā)揮作用。TGF-β1是一種多功能細胞因子，能促進新生血管生成，促進組織纖維化[13]。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）已經(jīng)成為研究創(chuàng)傷、疾病等病理過程中某些細胞因子含量變化的重要技術手段，其檢測結果較之免疫組化等法醫(yī)學傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察方法具有更高的靈敏度和準確性。

本研究檢測非急性硬膜下血腫及外周靜脈血中IL-12、TGF-β1含量的變化。結果顯示，與健康志愿者外周血內(nèi)IL-12、TGF-β1的含量相比較，硬膜下血腫患者血腫內(nèi)和外周血內(nèi)IL-12、TGF-β1的含量均顯著提高。這進一步證實局部炎癥反應，血腫外膜新生血管生成及再出血是非急性硬膜下血腫的發(fā)生、發(fā)展的重要機制，而 IL-12、TGF-β1可能是相關病理進程中的關鍵因子。

血腫內(nèi)IL-12含量隨血腫形成時間延長而下降，血腫形成7～14 d組最高，之后逐漸降低，分別是同組患者外周血內(nèi) IL-12 含量的 19.5、14.1、11.0倍，各組之間差異顯著（P＜0.01）。 與之相反，血腫內(nèi)TGF-β1含量隨血腫時間延長而逐漸增加，分別是同組患者外周血內(nèi) TGF-β1 含量的 21.1、54.8、94.4倍，各組之間同樣差異顯著（P＜0.01）。 上述變化規(guī)律為硬膜下血腫形成時間推斷提供了可能。同時，IL-12、TGF-β1不同的含量變化規(guī)律提示局部炎癥反應可能是硬膜下血腫發(fā)生和發(fā)展的早期機制，而新生血管的形成及再出血可能在非急性硬膜下血腫發(fā)展的中晚期起作用。

血腫患者較之健康自愿者外周血內(nèi)IL-12，TGF-β1 含量均顯著增高（P＜0.01），但各時間組之間無統(tǒng)計學差異，從這一結果看，全身性的細胞因子含量變化尚無法應用于損傷時間推斷，而創(chuàng)傷局部組織內(nèi)細胞因子的變化更具有法醫(yī)學意義。

硬膜下血腫發(fā)生、發(fā)展的研究尚無法通過統(tǒng)一的動物建模實現(xiàn)，因此符合實驗構想的病例樣本和檢材收集成為目前研究的關鍵。本研究在檢材收集過程中盡量避免各種可能的干擾因素，力求實驗樣本的標準、統(tǒng)一。我們將初次發(fā)現(xiàn)血腫至手術之間的時間間隔假定為血腫形成時間，并據(jù)此分組，而對于血腫發(fā)生至初次檢出之間的時間尚無法評估。本研究首次嘗試通過血腫內(nèi)細胞因子含量的變化推斷硬膜下血腫形成時間，實驗結果提示具有深入研究的價值，將更多的細胞因子納入檢測范圍，并且更加精細地進行時間分組將成為未來研究工作的重點。