不同濃度膽固醇建立動脈粥樣硬化斑塊模型的超聲評估

王佳玉， 周瑋， 王心宇， 畢小軍， 毛宇航， 孫杰

超聲成像廣泛應用于動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)疾病的檢查，對斑塊的發生、發展及治療效果的評估具有重要的監測作用。以前的模型建立主要用于內皮功能的研究或顯微鏡下的觀察[1]，不需產生超聲可見斑塊。隨著超聲技術的發展，超聲成像可以分辨斑塊回聲特性及斑塊新生血管密度進而評估斑塊的穩定性。因此，建立常規超聲可視的動物斑塊模型成為許多聲學實驗亟需解決的問題。目前，國內常用建立AS斑塊模型的高脂飲食膽固醇含量多為1%或2%[2-4]，所用的模型動物以兔為常見[5]。由于兔沒有肝酯酶，建模給予的高脂喂養常常會使血清膽固醇濃度很高，兔子內臟器官產生脂質沉著，大大縮短了動物壽命[6,7]。過低的膽固醇可能使血清膽固醇濃度累積較慢，建模時間延長[8]。自然發展的斑塊多位于腹主動脈，過低的膽固醇形成的斑塊主要位于主動脈弓和胸主動脈[9]，這些部位不利于超聲觀察。因此給予合適濃度的膽固醇對于建立可供超聲顯像分析的斑塊及實驗周期的長短非常重要。然而，關于不同濃度膽固醇含量的高脂飼料對建立聲學實驗所需AS斑塊的影響，國內外尚無類似研究的報道。本研究擬評價應用球囊擴張聯合不同濃度的高脂飼料，建立超聲可視兔AS斑塊模型的周期長短及效果，以期為聲學實驗根據不同的需要，選擇適宜濃度的高脂飼料建立AS模型提供參考。

材料與方法

1.實驗材料

新西蘭白兔65只，雄性，12周齡，體重1.8～2.5 kg(湖北省實驗動物中心提供)，5只為正常飲食的對照組，60只行球囊擴張聯合高脂喂養建立模型。高脂喂養分為1%膽固醇組28只與2%膽固醇組32只。其他實驗材料包括膽固醇 (Amresco分裝)、球囊(3.0～3.5) mm×15 mm(美國coridis公司)、Logiq E9彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)。

2.實驗方法

球囊擴張：經兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg麻醉后固定，分離右側股動脈后，肝素化的穿刺針與血管呈20°刺入股動脈后平行進入，送入直徑為3.0～3.5 mm球囊導管，超聲監測球囊至腹腔干水平后停止送入，導管外側端連接壓力泵，注入生理鹽水，維持壓力表為10～15 kPa，使球囊擴張后緩慢拉出球囊至股動脈分叉處，壓力表歸零后將球囊再次送入，如此重復3次，術后高脂喂養。

高脂喂養：球囊擴張前1周開始高脂喂養。高脂飼料分為2%膽固醇與1%膽固醇：2%膽固醇組采用2%膽固醇+3%蛋黃粉+3%豬油配置成高脂飼料，1%膽固醇組采用1%膽固醇+3%蛋黃粉+3%豬油配置成高脂飼料[8]，每只兔每日早100 g、晚50 g喂養，自高脂喂養8周后每4周進行一次超聲檢查。2%膽固醇組由于病死率較高，高脂喂養至20周時實驗截止，1%膽固醇組喂養至36周時實驗截止。

超聲檢查：實驗兔麻醉后左側位放于檢查臺上，右側腹備皮，采用Logiq E9超聲檢查儀，9L探頭行常規二維超聲檢查，探頭頻率9 MHz。以右腎動脈為標記，觀察并記錄每個斑塊距右腎動脈的距離、大小及斑塊回聲強度。

病理分析：取1%膽固醇飼料喂養36周及2%膽固醇飼料喂養20周的模型兔的斑塊，組織連續切成5 μm切片后行HE染色，測量纖維帽及脂質核心的厚度。免疫組化檢測斑塊內新生血管及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。

圖1 2%膽固醇組與1%膽固醇組的生存曲線圖。 圖2 1%膽固醇及2%膽固醇飲食喂養組的斑塊厚度變化圖。a)1%膽固醇組；b)2%膽固醇組。 圖3 AS斑塊聲像圖。 圖4 2%膽固醇組斑塊CD31染色，200倍顯微鏡放大后可見斑塊內新生血管、膽固醇結晶及大量泡沫細胞。 圖5 兩組斑塊內均可見大量VEGF表達。

表1 2組喂養組與對照組的血脂結果比較 (mg/dL)

注：與對照組比較，aP<0.05。

3.統計學分析

結 果

1.血脂分析結果

在高膽固醇飲食喂養8周時進行甘油三酯及膽固醇檢測，發現2%膽固醇組與1%膽固醇組兩組間各參數差異均無統計學意義(P值均>0.05)；但高膽固醇飲食喂養的兩組與對照組間差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

2.1%膽固醇組與2%膽固醇組兔生存分析結果

對照組無1只兔死亡，1%膽固醇組與2%膽固醇組模型兔的生存曲線差異有統計學意義(χ2=7.503，P=0.0062)，2%膽固醇組的生存時間明顯縮短，病死率較1%膽固醇組高，兩組的中位生存時間分別為102 d和170.5 d(圖1)。

3.超聲測量斑塊厚度變化

對照組無斑塊形成。1%膽固醇組在8周時基本無明顯可測量斑塊，在12周時可測得斑塊的平均厚度為(0.51±0.12) mm，隨后斑塊厚度緩慢增加，至24周時增加明顯，斑塊平均厚度為(0.73±0.21) mm，至32周時斑塊平均厚度達到最大為(0.85±0.29) mm(圖2)，隨后斑塊平均厚度降低。2%膽固醇組在8周時出現可測量斑塊，平均厚度為(0.54±0.16) mm，12周時斑塊厚度明顯增加，達(0.70±0.14) mm，16周時平均厚度達到最大，為(0.76±0.10) mm。高脂飲食喂養至相同周數時，2%膽固醇組的斑塊厚度明顯大于1%膽固醇組，差異均具有統計學意義(圖3)。

表2 2組纖維帽、脂質核心厚度比較

4.病理斑塊特性

HE染色發現兩組斑塊成份基本一致，鏡下可見大量泡沫細胞。部分2%膽固醇組斑塊內可見劍樣膽固醇結晶(圖4)，1%膽固醇組未見明顯膽固醇結晶。兩組斑塊內新生血管密度及纖維帽厚度、纖維帽與脂質核心厚度比差異均無統計學意義(表2)。免疫組化染色發現兩組斑塊內均可見大量VEGF表達(圖5)。

討 論

血管內皮是覆蓋在血管腔表面以保護平滑肌細胞的一個屏障，內皮細胞損傷誘發一系列炎癥反應是發生AS的必備條件，是形成易損斑塊的始動環節。球囊損傷內皮可加速AS斑塊的形成，在一定程度上可縮短造模時間，增強造模效果。但單純使用球囊拉傷方法很難得到理想的模型。相關研究發現，以高脂血癥和/或高膽固醇血癥為特征的血漿脂蛋白和脂質代謝異常是冠心病和AS的主要病因[9]，因此，通過給予高膽固醇飲食可以建立AS模型。但是，膽固醇的濃度、成模時間、病變進展等直接影響模型的制備。目前的高脂飼料成分及配比不盡相同，常用的是含膽固醇的高脂飼料，不同濃度的膽固醇飼料建模效果可能不同。飲食中膽固醇的含量及高脂喂養時間均可影響斑塊的組份。以往研究發現給予5.5%膽固醇與給予1%膽固醇所形成的高脂血癥程度相同[10]，給予0.3%～0.5%的膽固醇飲食可以使血清膽固醇水平達到1 000 mg/dl，給予1.0%～1.5%的膽固醇飲食8周后可使血清膽固醇水平達到1500～3000 mg/dl，并且形成以泡沫細胞為主的AS斑塊。基于此，目前國外采用0.3%膽固醇飲食喂養20～26周建立兔AS斑塊模型，但該方法形成的斑塊多局限于主動脈弓及胸主動脈，腹主動脈斑塊則少見[11,12]。本研究通過球囊擴張損傷腹主動脈內膜，聯合不同濃度膽固醇飲食建立兔腹主動脈AS斑塊模型，結果發現給予2%膽固醇與1%膽固醇在12周時兩組的血清膽固醇均達到很高水平，差異無統計學意義，與之前研究結果相符[10]。盡管血清中膽固醇水平無差異，但膽固醇含量低(0.15%)的飲食會導致脂肪條紋病變的發生，而當飲食中膽固醇含量較高時，則更容易產生動脈粥樣斑塊[13]。本研究中2%膽固醇組兔的生存率較低，推測可能是因為血清膽固醇過高使得內臟器官產生脂質沉著，引起動物抵抗力降低，繼發感染而死亡。

目前AS的檢查主要依賴于影像學檢查，常用的方法包括DSA、CT、 MRI及超聲檢查[14]，超聲檢查方便、快捷，在臨床上廣泛應用于AS血管的檢測。以往研究認為超聲測量兔腹主動脈內中膜復合體厚度≥0.5 mm即可判定為斑塊形成[15]。給予1%膽固醇飲食喂養8周以上即可通過血管內超聲觀察到斑塊形成[3]，目前國內各實驗建立的兔AS斑塊厚度多在0.5～1.5 mm之間。本研究通過常規二維超聲檢查發現2%膽固醇組喂養8周后部分實驗兔可見較小點狀斑塊，12周時基本已形成較大斑塊，16周時斑塊更為明顯。與之相反，1%膽固醇組斑塊形成時間長，斑塊出現時間晚于2%膽固醇組，在8周時斑塊不明顯，在24周左右時斑塊較明顯，32周時最為明顯。由于斑塊厚度大的模型兔死亡，2%膽固醇組、1%膽固醇組分別在16周、32周以后平均斑塊厚度下降。由此可見，若實驗中為降低病死率而使用1%膽固醇需要更長時間建模，但斑塊平均厚度增加。

綜上所述，本研究發現應用球囊擴張聯合高脂喂養的方法可以成功建立超聲檢查所見的AS斑塊模型，給予2%膽固醇喂養可在較短時間內建立斑塊模型，但斑塊兔存活時間短，病死率較高。給予1%膽固醇喂養建模時間長，但斑塊兔存活時間長，兩者所建立的斑塊從病理學角度無明顯差異。本研究結果可為聲學實驗選擇合適濃度的高脂飼料建立AS模型提供參考，具有重要的理論和實踐意義。