新城疫病毒熒光RT-PCR檢測方法的建立

郭瑩瑩 王世狀

（黑龍江省前進農場 156331）

新城疫是由新城疫病毒起地對家禽養殖業危害較大的一種傳染性疾病。該病毒傳播速度快，比較難控制，是檢驗檢疫中要求嚴格檢驗控制的一種病毒。PCR 技術克服了傳統的病原分離及常規血清學診斷等方法的費時、費力、敏感性和特異型較差的缺點，已被應用與多種病原微生物的鑒定和檢測。為了適應活禽、禽肉制品中，快速、特異的特點，本實驗采用“新城疫病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒”，建立快速檢測NDV 的熒光RT-PCR 方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

RT-PCR 新城疫診斷試劑盒由北京出入境檢驗檢疫局技術中心和深圳市匹基生物工程股份有限公司聯合生產。

試劑：PBS 溶液、氯仿、無水乙醇、異丙醇。

樣品A：新城疫病毒，分離自接種病毒雞體。

樣品B：新城疫標準陰性對照，來自試劑盒。

樣品CDEFG：新城疫疑似病毒，分離自農戶家甲、乙、丙、丁、戊病死雞體。

樣品H：新城疫標準陽性對照，來自試劑盒。

1.2 試驗設備

小型離心機、混勻器、冰箱（4℃，-20℃）、熒光PCR 檢測儀、臺式高速離心機、吸頭、1.5mL 滅菌離心管、移液器、記號筆、吸水紙、微量板、鑷子。

1.3 方法

1.3.1 病毒RNA 的提取

（1）分別向每瓶樣品中加入2mLPBS 溶液，使其充分溶解。

（2）取8 個1.5ml 滅菌離心管，做好標記。

（3）每個離心管加入600μL 裂解液，然后分別加入待測樣品、陰陽對照各200μL； 再加入氯仿200μL，混勻器上振蕩混勻5s。

（4）在4℃條件下，12000g 離心15min。

（5）取與步驟1 中相同數量的1.5ml 離心管，加入400μL異丙醇（-20℃預冷），做好標記。吸取步驟4 各管中的上清液相轉移至相應的管中，顛倒混勻。

（6）12000g 離心15min。輕輕倒去上清，倒置于濾紙上，沾干液體； 加入75%乙醇600μL，顛倒洗滌。

（7）12000g 離心10min。輕輕倒去上清，倒置于上吸水紙上，盡量沾干液體。

（8）4000g 離心15min。將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，室溫干燥3min。

（9）加入11μL DEPC 水輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000g 離心5s，冰上保存備用。

1.3.2 擴增試劑準備

（1）從試劑盒中取出相應的RT-PCR 反應液，Taq 酶，在室溫下融化后，在2000r/min 離心5s，則所需的PCR 數為16，每個測試體系配制如下，把RT-PCR 反應液和Taq 酶按每個PCR 反應管加15μL 的PCR 和1/4 顆（即一顆加4 個孔）的比例配成反應液。

（2）把試劑盒中的PCR 板條取出，放在微量板上，在各設定的PCR 板條管中分別加入上述病毒提取步驟（9）中制備的RNA 溶液各10μL，蓋緊管，使用臺式離心機在17℃下9600g離心20min，取出板條，放入熒光PCR 熒光檢測儀內，記錄樣本擺放順序。

（3）循環條件設置。

表1 PCR 循環條件程序

儀器檢測通道選擇F1 通道

（4）結果分析條件設定

讀取F1 通道的檢測結果。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。

2 判定依據

CT 值無數值的為陰性，CT 值≤40.0 的樣本為陽性樣本。同時，陰性對照的檢測結果為陰性，陽性對照的檢測結果為陽性。

3 結果

熒光RT-PCR 儀對試驗樣品的檢測結果見表2 和附圖。

從表2 和附圖可以看出，接種的新城疫病毒，新城疫陽性（試劑盒）為陽性，因為只要是陽性就有對數增長期。所選的幾種疑似病例中以農戶家里的曲線走的好，從圖上的順序來看，其曲線中較高的一條（C1）高于新城疫接種病毒的較低的一條（A2）。其兩條曲線（C1，C2）均高于新城疫陽性對照（H1，H2），這說明它是致病性較強的毒株。而樣品D、E、F、G 均為陰性。從本試驗中可以得出，疑似病例中只有農戶家甲為強毒株，而由其他農戶家的疑似病例產生的新城疫病毒均為弱毒株或無毒性。

4 實驗結論

通過采用RT-PCR 方法來檢測新城疫病毒毒性強弱程度的同時發現，該檢測方法具備了多項操作優勢：

（1）快速：與雞胚病毒分離方法相比，在時間上來講，從至少需要21d 縮短為4h；

（2）靈敏：針對感染性雞胚尿囊液，人工感染SPF 雞等方面有與雞胚病毒分離方法的敏感性基本一致；

（3）準確：與雞胚病毒分離相比，特異性基本一致；閾值為：0.172

表2 熒光RT-PCR 對試驗樣品的檢測結果

附圖 試驗樣品的熒光RT-PCR 圖

（4）操作簡單：本試劑盒給檢測者提供了質量優異的試劑及優化的操作程序，經過簡單的培訓，檢測者可勝任該項工作。