一株乳酸片球菌的篩選、鑒定及其固態發酵飼料原料的產酸分析

李慧芬， 王文博， 馬 成

（1.青島根源生物技術集團有限公司技術支持中心，山東青島266111；2.青島根源生物技術集團有限公司固體發酵實驗室，山東青島 266736）

乳酸菌被廣泛應用于食品發酵、制造及醫療保健領域，其不僅具有良好的抑菌防腐功能，還具有改善食品風味、增強食品營養的作用（Reis，2012；Schnurer，2005）。 乳酸菌包括乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、 乳桿菌 （Leuconostoc） 和肉食桿菌（Carnobacterium）等屬（凌代文等，1999）。

乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）屬于硬壁菌門 （Firmicutes）桿菌綱 （Bacilli）乳桿菌目（Lactobacillales）氣球菌科（Aerococcaceae）片球菌屬（Pediococcus），其主要依賴碳水化合物作為碳源進行生長，可能以糖酵解途徑產生D-乳酸或L-乳酸 （Nieto等，2006）。 乳酸片球菌能發酵產生有機酸、細菌素、環二肽、短鏈脂肪酸等多種抑菌物質（Wang，等，2014）。 目前，有關乳酸片球菌的研究多涉及細菌素的分離純化及抑菌效果，關于其固態發酵飼料原料產酸的研究較少。因此，本研究從豬的新鮮糞便中分離純化出一株具有較強產酸效果的乳酸菌，經形態、生理生化與分子鑒定，確定為乳酸片球菌，并對其發酵不同飼料原料的產酸效果進行分析，以期為該菌在固態發酵飼料原料中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 固態發酵原料 豆粕采用渤海46蛋白豆粕；麩皮采用二級小麥麩；玉米粉采用一級玉米粉；稻殼粉采用40目精致稻殼粉。固態發酵原料均來自根源生物技術集團固體發酵實驗室。

1.1.2 MRS培養基 液體培養基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、K2HPO4·7H2O 0.2%、吐溫 80 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025% 、pH 6.2；固體培養基：在液體培養基的基礎上另加0.5%CaCO3、2%瓊脂粉。

1.1.3 菌株的分離純化 選取山東中慧昌樂豬場杜洛克豬新鮮糞便6份，各取1 g溶于100 mL無菌生理鹽水中，取1 mL與9 mL無菌生理鹽水混合，稀釋10倍，依次在含9 mL無菌生理鹽水的試管中梯度稀釋到10-8稀釋度。選取 10-5～10-8稀釋度的菌液，從中吸取1 mL到無菌培養皿中，傾注至滅菌后冷卻到45℃的MRS固體培養基，37℃恒溫培養72 h，鏡檢排除產芽孢的菌，挑取透明圈較大的菌。乳酸菌的菌落很小，大約1～3 mm，圓形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黃色，且菌落周圍有透明的碳酸鈣溶解圈。在含有MRS固體培養基的平板上，將篩選出的菌株進行劃線純化三次，確保菌落純度。

1.1.4 乳酸菌的液體培養 接種每株菌的單菌落到MRS液體培養基中，50 mL磨砂口錐形瓶內裝液量為30 mL，37℃靜置培養24 h。

1.2 菌株固態發酵豆粕與產酸優勢菌篩選 按1%接種比例，1：0.5的料水比，接種乳酸菌液到1000 g豆粕中，37℃恒溫培養48 h。

1.3 產酸優勢菌形態、生理生化與分子鑒定

1.3.1 產酸優勢菌的形態與生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》，對產酸優勢菌的菌落菌體特征、生理生化特性等進行測定。

1.3.2 產酸優勢菌的16SrDNA序列分析 應用普通細菌基因組DNA提取試劑盒，提取產酸優勢菌的DNA，并以其為模板，采用細菌通用引物27 F和 1492 R，進行16SrDNA PCR擴增 （王延華等，2005）。擴增條件：94℃預變性5 min，隨后循環擴增35循環 （94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s），最后72℃延伸10 min。PCR產物送青島睿博興科公司測序。將獲得的16SrDNA的序列在NCBI官網上進行Blast比對，獲得代表性模式序列，應用MEGA 4.0軟件按照UPGMA法進行系統進化樹構建（Tamura等，2007）。

1.4 產酸優勢菌固態發酵飼料原料的產酸分析

1.4.1 產酸優勢菌固態發酵飼料原料的條件 按1%接種比例，1：0.5的料水比，接種乳酸菌液到1000 g豆粕、麩皮、玉米粉或稻殼粉中，37℃恒溫培養48 h。

1.4.2 產酸優勢菌固態發酵料的指標測定 pH指標：取10 g發酵料，加50 mL純凈水，混合均勻后靜置10 min，用PHS-3C型pH計（上海精科）測定發酵料pH指標。

L-乳酸指標：采用HPLC方法測定，取1 g樣品加100 mL純凈水磁力攪拌1 h，取2 mL液體12000 r/min離心10 min，取上清液用0.22μm濾膜過濾。高效液相條件：流動相（50 mM磷酸二氫鉀：乙腈=90：10）；流速：1.25 mL/min；C18 柱，紫外檢測器，波長 210 nm；柱溫箱：40℃；進樣量：20μL（Jannicke等，2006）。

揮發性脂肪酸（VFA）指標：采用 SP-2100A氣相色譜儀 （北分瑞利 ），毛細管柱型號 KBFFAP 30 m×0.32 mm×0.25μm，柱溫 130℃，汽化溫度 180℃，應用氫離子火焰檢測器，檢測溫度180℃，載氣為高純氮氣，通過內標法（巴豆酸）定量各組分（秦為琳等，1982）。

發酵0 h與48 h，分別測定發酵料的pH、L-乳酸與VFA指標，每組3個重復。

1.5 統計分析 試驗數據經Microsoft Excel初步處理后，利用SPSS 16.0統計軟件進行方差分析，如果方差分析結果差異顯著，則采用LSD法進行多重比較，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 固態發酵豆粕的產酸優勢菌篩選 從6個糞便樣品中共獲得20株乳酸菌，固體發酵豆粕48 h時的pH如圖1，其中14號菌株的pH最低，為4.86，與其他組的固態發酵豆粕產酸效果差異顯著（P＜0.05），命名該菌株為HF 14。

圖1 不同菌株發酵豆粕48 h的p H

2.2 HF 14的形態、生理生化與分子鑒定

2.2.1 HF 14的形態與生理生化鑒定結果 產酸優勢菌HF 14為革蘭氏陽性菌，菌體呈乳白色，與碳酸鈣形成的透明圈約6～9 mm，有較強的產酸能力。生理生化特性顯示該菌不運動，不形成芽孢，菌體為球型，不成鏈狀。該菌兼性厭氧，主要發酵單糖與雙糖，葡萄糖產酸不產氣，主要產物是乳酸鹽。接觸酶為陰性，氧化酶也為陰性。不還原硝酸鹽，主要生長溫度為35～40℃，50℃也能生長，在6.5%NaCl、pH 4.5條件下也能生長。具體的生理生化特性見表1。

表1 產酸優勢菌HF 14的生理生化特征

2.2.2 HF 14的16SrRNA序列分析 產酸優勢菌在通用引物27 F和1492 R的擴增下，得到1456 bp序列，并與GenBank數據庫中的模式菌比對 ，該菌株的16S序列與Pediococcus acidilactici strain GL16的16S序列99%相似，MEGA系統進化樹上也與該類菌親緣關系最近，如圖2。綜合菌株HF 14的形態、生理生化、16SrDNA序列分析，初步鑒定該菌株 HF 14為乳酸片球菌。

2.3 HF 14發酵不同原料的產酸類別分析 由表2可知，四種飼料原料經乳酸片球菌HF 14發酵后，pH均顯著下降（P＜0.05），尤其是麩皮，發酵后pH降幅達2.18。稻殼粉的起始pH較低，降幅也最低，僅1.27，但與發酵前相比，發酵后pH也顯著下降（P＜0.05）。

圖2 產酸優勢菌HF 14的16S rDNA系統進化樹

四種飼料原料經乳酸片球菌HF 14發酵后，L-乳酸含量均顯著增加（P＜0.05），尤其是玉米粉，發酵后L-乳酸增幅達21.5。稻殼粉發酵前L-乳酸含量最低，發酵后比發酵前顯著增加 （P＜0.05），但與其他原料相比，增幅最低，為5.31。

VFA是厭氧發酵過程中經水解階段產生的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等揮發性脂肪酸的總和，但是在厭氧發酵中最主要的是乙酸，其次是丙酸與丁酸，其他的含量非常少，可忽略不計（Yuan等，2011）。本試驗中，稻殼粉組發酵后乙酸含量顯著增加（P＜0.05），增幅達5.73，顯著高于其他飼料原料組，丙酸與丁酸含量無顯著變化（P＞0.05），說明稻殼粉經乳酸片球菌HF 14發酵后產生的VFA以乙酸為主。豆粕、麩皮、玉米粉三種飼料原料經HF 14發酵后產生的VFA也是以乙酸為主，其次是丙酸，最后是丁酸，與發酵前相比，都有顯著增加（P＜0.05）。三種飼料原料中，豆粕的初始乙酸含量較高，發酵后麩皮與玉米粉的乙酸含量增加較大；丙酸的初始含量無顯著差異（P＞0.05），發酵后玉米粉的增幅最大；麩皮的初始丁酸含量較高，發酵后增幅也最大，其次是玉米粉。

表2 產酸優勢菌HF 14發酵不同飼料原料的產酸類別分析

3 討論

pH作為一個重要的環境因素，不僅能夠影響微生物酶的活性，也能影響發酵產物的組成（Zhang，2009；Chen，2007；Horiuchi，2002）。稻殼粉發酵前pH為5.72，顯著低于其他飼料原料（P＜0.05），發酵后產酸的VFA中乙酸占97.6%，在數值上甚至超過了L-乳酸（張玉靜等，2013）。而乳酸可以被氧化為丙酮酸，進而脫羧轉變為乙醛，再被氧化成為乙酸，推測稻殼粉經乳酸片球菌HF 14固態發酵過程中，最初產生的乳酸，部分發生了一系列生化反應轉變為乙酸。豆粕、麩皮、玉米粉這三種飼料原料經乳酸片球菌HF 14發酵后產生的有機酸中，L-乳酸含量在數值上占較大優勢。乳酸能維持動物腸道菌群平衡，減少腹瀉，促進鈣質的吸收。動物體內含有L-乳酸脫氫酶，只能分解自身產生或攝入的L-型乳酸 （Abdel等，2011）。 因此，高光學純度的L-型乳酸更受市場青睞。乙酸是厭氧發酵過程中重要的中間代謝產物，是很好的抗微生物劑、酸度調節劑和酸味劑，但是有較為刺激的氣味。不同原料發酵時乙酸也是重要的有機酸，如在畜禽糞便厭氧發酵系統中乙酸占 VFA 的 40%以上（NI，2011；Wu，2010），而秸稈厭氧發酵時，乙酸可以占到46%以上（Zhao等，2014）。丙酸是飼料、醫藥、食品工業等領域的重要原料，具有很好的防真菌和霉菌的作用，效果優于苯甲酸，是極佳的食品防腐劑 （徐親民等，1997）。本試驗中，乳酸片球菌HF 14發酵玉米粉的丙酸含量最高。丁酸是腸膜細胞的主要能量來源，還可促進腸黏膜修復及其功能恢復，并且能抑制炎癥細胞因子的形成，從而起到抗炎癥作用（胡仁偉，2003；Augeulieht，2002）。 然而，本試驗中各組的丁酸含量都不高，最高的發酵麩皮僅0.72 mg/g。丁酸的生產需丁酸梭菌等特定菌的引入，且對代謝條件進行誘導干預。

同一株乳酸片球菌，采用同樣的固態發酵工藝發酵不同的飼料原料，產生的有機酸以L-乳酸與乙酸為主，且不同的飼料原料發酵后有機酸的類別有一些差異。其中發酵玉米粉的pH最低，L-乳酸與丙酸含量最高;發酵麩皮的pH降幅最大，丁酸含量最高；發酵稻殼粉的乙酸含量最高，L-乳酸含量最低；發酵豆粕的各個指標居中。

4 結論

研究篩選到1株固態發酵豆粕產酸效果較強的菌，經鑒定為乳酸片球菌。對乳酸片球菌HF 14固態發酵豆粕、麩皮、玉米粉與稻殼粉的產酸類別進行分析發現，產生的有機酸以L-乳酸與乙酸為主，其中，發酵玉米粉的pH最低，為3.77，L-乳酸與丙酸含量最高，分別為21.91、1.03 mg/g；發酵麩皮的pH降幅最大，丁酸含量最高，為0.72 mg/g；發酵稻殼粉的乙酸含量最高，為6.15 mg/g，L-乳酸含量最低；發酵豆粕的各個指標居中。