抑制人結腸癌HT-29細胞增殖乳酸菌有效成分的篩選

王淑梅，張蘭威*，張莉麗，張 爽，易華西

（1.哈爾濱學院 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150086；2.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266100；3.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌是生活在機體內并且有益于宿主健康的一類活的微生物，通常指具有高選擇性的乳酸菌，其通過菌體細胞各組分發揮功能作用，如細胞壁、細胞質、菌體肽聚糖和菌體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）等[1-2]，其中最常見的是乳酸桿菌（Lactobacillus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium）。目前，關于乳酸菌提高人體免疫功能[3]、抗腫瘤及抑菌作用[4-5]的研究已有相關報道。隨著對乳酸菌研究的不斷深入，各種功能性乳酸菌新品種相繼涌現。

目前，功能性乳酸菌的篩選方法主要有3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）。如采用MTT試驗篩選具有抑制癌細胞增殖作用的菌株KFRI342細胞質[6]；具有抑制人結腸癌細胞系HT-29細胞、Caco-2細胞和SW480細胞增殖作用的青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）SPM0212丁醇提取物[7]；具有抑制人早幼粒急性白血病細胞HL-60生長與增殖作用的植物乳桿菌（Lactococcus plantarum）培養上清液[8]；具有抑制胃癌細胞和結腸癌細胞增殖作用的熱致死菌體細胞、細胞質和菌體肽聚糖[9]。同樣，也有研究者采用MTT試驗篩選出具有抑制結腸癌細胞系SNUC2A和胃癌細胞SNU-1增殖作用的乳酸乳球菌（Lactococcus lactisssp.lactis）細胞質[10-11]，并通過形態學4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色和DNA損傷試驗證實其可誘導胃癌細胞SNU-1的凋亡[12]。

課題組前期從中國西部傳統發酵食品中分離并篩選出4株具有潛在抗結腸癌功效的乳酸菌X11、X12、M5和K14[13]。本研究以這4株菌為研究對象，分離其細胞壁和細胞質。首先通過MTT法初步篩選具有抑制HT-29細胞增殖能力的成分，再通過研究分離成分對人結腸癌細胞系HT-29細胞的DNA損傷、細胞凋亡及周期的影響，最終獲得具有抗結腸癌作用乳酸菌成分，為進一步明確乳酸菌在抑制結腸癌過程中發揮的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及細胞

人結腸癌細胞系HT-29：中國醫學科學院腫瘤研究所；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）X11、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei susbp.paracasei）X12：來源于新疆乳酪；L.caseiK14：來源于西藏酸乳酒；L.paracaseisubsp.paracasei M5：來源于新疆馬奶酒。以上乳酸菌保存于哈爾濱工業大學化學工程與技術學院微生物學實驗室。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG ATCC 43121（LGG）：美國模式菌種收集中心（American type culture collection，ATCC）。

1.1.2 試劑

RPMI 1640培養基、胰酶消化液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國Corning公司；噻唑藍（MTT）：美國Sigma-Aldrich公司；Annexin V-FITC試劑盒、細胞DNA提取試劑盒：美國BD公司；胎牛血清：杭州四季青有限公司；PI染色液：北京Solarbio公司。

1.2 儀器與設備

Universal Hood II凝膠成像系統、Bio-Rad-500酶標儀：美國Bio-Rad公司；FACS Calibur流式細胞儀：美國R&D System公司；HEPA1100二氧化碳培養箱、ULT-1386-3-V超低溫冰箱：美國Thermo Electron公司；CX31電子顯微鏡：日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌細胞壁及細胞質蛋白質含量的檢測

以菌株LGG為陽性對照，參照AMROUCHE T等[3-4]的方法分離4株乳酸菌的細胞壁和細胞質，并采用考馬斯亮藍法測定細胞壁及細胞質中的蛋白質含量[14]。

1.3.2 細胞毒性的檢測

首先采用MTT實驗測定乳酸菌的細胞壁及細胞質對HT-29細胞的抑制效果，具體方法如下：調整HT-29細胞濃度為1×105個/mL，取100 μL接種于96孔培養板中，待細胞完全貼壁，加入乳酸菌X11、X12、M5和K14細胞壁和細胞質，使各實驗組細胞壁和細胞質蛋白質終質量濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL[15]。將96孔培養板置于CO2培養箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中培養48h。當培養44h時，加入10μLMTT，再繼續培養4h[16]，吸出液體，加入150 μL DMSO[17]。以只加RPMI 1640培養液的細胞為陰性對照，采用酶標儀測定細胞在波長490 nm處的吸光度值（OD490nm值）。計算乳酸菌細胞壁和細胞質對HT-29細胞抑制率，其計算公式如下：

然后采用改良寇式法[9]計算細胞壁及細胞質對HT-29細胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），利用IC50值分析乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞的作用大小[18]。

1.3.3 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞DNA損傷的檢測

調整HT-29細胞濃度為5×105個/mL，加入6孔組織培養板中，每孔2 mL。待細胞完全貼壁后加入乳酸菌細胞壁和細胞質，使其蛋白質終含量為80 μg/mL，將6孔組織培養板置于CO2培養箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中培養48 h。培養結束后，用預冷的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗細胞，加入0.25%的胰酶和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合液2mL，置于CO2培養箱（37℃，5%CO2，95%空氣，100%濕度）中消化1～2 min。1 000×g離心5 min，收集細胞，再用預冷PBS溶液清洗細胞2次。采用細胞DNA提取試劑盒提取細胞DNA，采用1.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測[19]。

1.3.4 HT-29細胞凋亡及壞死檢測

采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測HT-29細胞的凋亡及壞死情況[20-21]。

1.3.5 HT-29細胞周期的測定

采用流式細胞儀進行細胞周期分析[22]。

1.3.6 數據處理及統計分析

實驗重復3次，通過SAS 9.1軟件進行方差分析，實驗結果采用平均值±標準偏差（X±SD）的方式表示，顯著性水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌細胞壁和細胞質蛋白質含量的測定

以牛血清蛋白質量濃度（X）為橫坐標，OD595nm值（Y）為縱坐標繪制牛血清蛋白標準曲線，通過線性擬合得到標準曲線回歸方程為：Y=0.006 3X，相關系數R2=0.996，說明OD595nm值與牛血清蛋白質量濃度線性關系良好。乳酸菌細胞壁及細胞質蛋白含量的測定結果見表1。

由表1可知，乳酸菌細胞壁及細胞質中的蛋白質含量為244.31～1 557.14 μg/mL，4株乳酸菌細胞壁及細胞質中的蛋白質含量與陽性對照LGG差異顯著（P＜0.05）。其中，副干酪乳桿菌M5細胞質及細胞壁中的蛋白質含量較高，分別為976.19 μg/mL，907.62 μg/mL；乳酸菌K14細胞壁中的蛋白質含量（1 144.44 μg/mL）僅低于陽性對照組LGG細胞質；而乳酸菌K14、X12、X11細胞質中的蛋白含量均處于較低水平，分別為246.88 μg/mL、247.33 μg/mL、244.3 μg/mL。結果表明，同種菌屬不同菌株之間細胞成分中的蛋白質含量不同。在此基礎上進行后續抑癌研究。

表1 乳酸菌細胞壁和細胞質蛋白質含量Table 1 Protein content in the cell wall and cytoplasm of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞的毒性作用

表2 乳酸菌細胞壁和細胞質對HT-29細胞的半抑制濃度值Table 2 Half maximal inhibitory concentration value of lactic acid bacteria cell wall and cytoplasm on HT-29 cells

由表2可知，乳酸菌M5和K14的細胞壁及細胞質、乳酸菌X12和X11的細胞壁對HT-29細胞的IC50值均顯著低于陽性對照組LGG細胞壁（109.74 μg/mL）及細胞質（102.32 μg/mL）（P＜0.05），其中，乳酸菌X11細胞壁對HT-29細胞的IC50值（55.31 μg/mL）最低，抑制效果最好。而乳酸菌X12和X11細胞質對HT-29細胞的IC50值顯著高于陽性對照組LGG細胞質，分別為135.25 μg/mL、124.80 μg/mL（P＜0.05），抑制效果最差。

2.3 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞DNA的作用

由于含80 μg/mL蛋白質的乳酸菌細胞壁或細胞質持續作用于HT-29細胞48 h后，便可達到抑制HT-29細胞的作用，因此，本實驗選用含80 μg/mL蛋白質的細胞壁和細胞質對HT-29細胞進行處理。細胞DNA降解是細胞凋亡的晚期階段主要特征之一，在細胞凋亡后期，細胞DNA降解成小分子片段[23-24]，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞DNA的作用，結果見圖1。

由圖1可知，乳酸菌細胞壁及細胞質持續作用于HT-29細胞48h后，細胞DNA出現彌散拖尾形態，但沒有產生明顯的DNA小分子片段。DNA損傷是細胞發生凋亡的一項重要標志[21]，有研究顯示[22]，乳酸菌可通過誘導結腸癌細胞DNA損傷而實現其抗結腸癌功能，如嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）606可溶性胞外多糖通過誘導HT-29細胞DNA損傷而誘導細胞凋亡[23]。

圖1 乳酸菌細胞壁（a）及細胞質（b）處理HT-29細胞后的DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of DNA of HT-29 cells after treated with lactic acid bacteria cell wall(a)and cytoplasm(b)

2.4 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞的影響

表3 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞的影響Table 3 Effect of lactic acid bacteria cell wall and cytoplasm on HT-29 cells

由表3可知，與陽性對照組LGG細胞壁相比，乳酸菌X12、K14細胞壁顯著促進HT-29細胞的死亡（P＜0.05），使HT-29細胞早期凋亡細胞數分別提高72.38%、65.03%，壞死細胞數分別提高63.13%、1.69%，晚期凋亡細胞數分別提高127.18%、92.22%；乳酸菌M5細胞壁顯著促進HT-29細胞的壞死及晚期凋亡（P＜0.05），使壞死細胞數提高65.59%，晚期凋亡細胞數提高137.14%。與陽性對照LGG細胞質相比，乳酸菌M5細胞質使HT-29細胞的早期凋亡細胞數提高96.16%，壞死細胞數提高7.31%，晚期凋亡細胞數提高20.08%。而乳酸菌X11細胞壁和K14細胞質作用HT-29細胞48 h，早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞數均低于陽性對照組LGG。結果表明，乳酸菌X12、M5和K14細胞壁對HT-29細胞死亡具有顯著的誘導作用。為確認乳酸菌X12、M5和K14細胞壁對HT-29細胞凋亡的誘導，進一步研究乳酸菌X12、M5和K14細胞壁對HT-29細胞周期的影響。

2.5 乳酸菌細胞壁及細胞質對HT-29細胞周期的影響

細胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和細胞分裂期（M期）4個周期。乳桿菌X12、M5和K14細胞壁作用HT-29細胞后，其細胞周期變化情況見表4。

表4 乳酸菌細胞壁對HT-29細胞周期的影響Table 4 Effect of lactic acid bacteria cell wall on HT-29 cells cycle

本研究中細胞周期阻滯實驗均與對照組Control進行比較。相對于Control（G1期為70.11%），M5和X12細胞壁處理HT-29細胞后G1期顯著提高了（分別為76.06%和83.52%），同時M5的S期也顯著增高了（為22.92%），因此初步認為M5和X12細胞壁將HT-29細胞周期阻滯在了G1期。相對于Control（S期為10.84%），K14細胞壁處理HT-29細胞S期顯著提高了（26.25%）。因此初步認為菌株K14細胞壁將HT-29細胞阻滯在了S期。通過本研究發現，乳酸菌X12、M5和K14細胞壁抑制HT-29細胞的增殖，并誘發癌細胞的凋亡，這一過程是通過調控癌細胞周期而實現。

3 結論

本研究以鼠李糖乳桿菌LGG為陽性對照，研究4株乳酸菌X11、X12、M5和K14細胞壁、細胞質對人結腸癌細胞系HT-29細胞毒性、DNA損傷、細胞死亡及細胞周期的影響，篩選具有抗結腸癌作用的有效成分。結果表明，與陽性對照LGG相比，乳酸菌X11、X12、M5、K14細胞壁和乳酸菌M5、K14細胞質對HT-29細胞增殖能力有顯著的抑制作用（P＜0.05）；HT-29細胞經乳酸菌細胞壁或細胞質（蛋白質含量為80 μg/mL）處理48 h后，細胞DNA出現了明顯的彌散拖尾形態；乳酸菌X12、M5和K14細胞壁對HT-29細胞死亡具有顯著的誘導作用，并調控癌細胞的周期分布。通過以上篩選模式最終獲得乳酸菌X12、M5和K14的細胞壁成分具有抗結腸癌效果，為后續其對結腸癌HT-29細胞周期調控機制的研究奠定了基礎。