蘋果酸-乳酸發酵對威代爾冰酒香氣的影響

曲昆生，曲天波，曲 林，張 濤，包 振，于東華，倪元穎*

（1.煙臺北方安德利果汁股份有限公司，山東 煙臺 264100；2.中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083）

冰酒是將成熟后的葡萄延遲采收，在氣溫低于-7℃的自然條件下冷凍濃縮，并在結冰狀態下采收、壓榨，最終發酵釀制而成的一種高檔甜型葡萄酒[1]。掛果期的反復凍融及失水濃縮使得最終釀制而成的冰酒具有獨特的風格，深受消費者的喜歡。甜酸平衡對冰酒的和諧感極其重要，若酸度過低會使得冰酒過于甜膩，但若酸度過高，將會使冰酒口感酸澀、粗糙、生硬，酒體不和諧。在桓仁產區，由于其特殊的氣候，威代爾冰酒酸度偏高，且有50%都是蘋果酸[2]，因此，可進行適當的降酸，以提高冰酒的品質。

蘋乳發酵（malo-lactic fermentation，MLF）法是一種柔和的生物降酸方式，其不僅能降低酸度，還能提高生物學穩定性、修飾風味，使最終葡萄酒變得柔和、圓潤，為了保證蘋乳發酵的順利進行，并達到預期的釀造目標，很多已經開始人為接種乳酸菌來啟動蘋乳發酵。目前，常用的乳酸菌接種方式為有同時接種發酵和順序接種發酵（se-inoculation fermentation，Se-F）[3]。對冰酒發酵來說，由于其特殊的保糖發酵釀造工藝，在酒精發酵結束后很難做到既抑制酵母代謝，又保證乳酸菌（Lactobacillus）正常繁殖代謝，因而酵母菌（Saccharomyces）并不適合順序接種發酵法。而在酒精發酵旺盛期接種乳酸菌并不合適，因為此時酵母菌已占據絕對的優勢，營養物質減少，SO2、乙醇的存在以及酵母代謝產生的有害物質（如中長鏈脂肪酸），會抑制乳酸菌的生長[4]，因此，在冰酒中最好采用酵母菌和乳酸菌同時接種法進行蘋乳發酵。目前尚未有在高糖高滲透壓的冰葡萄汁中進行蘋乳發酵的相關研究報道。

香氣物質是葡萄酒中具有揮發性且能夠產生一定氣味的呈香物質的總稱，是構成葡萄酒感官特性的一類重要風味物質，揮發性香氣物質的種類、含量、閾值及其相互之間的作用決定了葡萄酒的風格和典型性，影響著葡萄酒的質量。葡萄酒的風味物質主要包括了高分子量的非揮發性物質和低分子質量的揮發性物質，這些物質間的協調、累加、削減等作用決定了葡萄酒最終的質量[5]。此外有機酸含量是葡萄酒中重要的質量指標，在很大程度上決定了葡萄酒的酸度，其種類、濃度以及比例不僅影響著葡萄酒的口感、色澤，還影響著其生物穩定性[6]。本實驗通過對中國遼寧桓仁產區的威代爾冰葡萄汁進行酒精和蘋果酸-乳酸同時發酵（co-incoluation fermentation，CO-F），以單一酒精發酵（alcoholic fermentation，AF）為對照，采用液相色譜（liquid chromatography，LC）、頂空固相微萃取（headspacesolidphase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜（gaschromatograph-mass spectrometer，GC-MS）聯用技術，測定威代爾冰葡萄酒中有機酸和揮發性香氣物質含量，并進行感官評定，探究蘋果酸-乳酸發酵對威代爾冰酒香氣的影響，以期達到降酸和改良葡萄酒風味的目的，為后續生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

威代爾葡萄原料：采自遼寧桓仁滿族自治縣二棚甸子鎮，原料樹齡5年，小棚架栽培，株行距0.5 m×2.0 m，每畝產量控制在500kg左右。活性干酵母R2、直投式乳酸菌Oenoi1：法國Lallemand公司。

1.1.2 化學試劑

草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；葡萄糖、酒石酸、氯化鈉、磷酸氫二銨、磷酸（均為分析純）：北京國藥集團化學試劑有限公司；4-甲基-2-戊醇、乙酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、異戊醇、己醇、順式-3-己烯醇、反式-3-己烯醇、順式-2-己烯醇、反式-2-己烯醇、辛醇、2,3-丁二醇、癸醇、苯甲醇、苯乙醇、己酸、辛酸、癸酸、里那醇、4-松油醇、香茅醇、香葉醇、紫羅蘭酮、萘（純度均＞97.0%）：美國Sigma公司；正構烷烴C7～C4（0500mg/L于己烷）：上海安譜實驗科技有限公司；乙醇（色譜級）：香港J&K貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA124S-CW分析天平：德國塞利多斯公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；LC 20A-二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）：日本島津公司；TechMate C18-ST色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：北京泰克美公司；Aglient 7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX 毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）/碳篩（Carboxen，CAR）/二乙苯烯（divinylbenzene，DVB）萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 威代爾冰酒發酵工藝

冰葡萄→壓榨→冰葡萄汁→回溫→接種→控溫發酵→終止發酵→澄清→過濾→灌裝→成品

操作要點：葡萄在-8℃以下采摘后，采用壓榨機立即低溫壓榨，壓榨完后冰葡萄汁加熱回溫至20℃，轉入10 L的發酵罐，接入300 mg/L酵母進行單一酒精發酵（AF），對照處理在接入300 mg/L酵母菌48 h后，接入20 mg/L乳酸菌同時進行酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵（MLF），發酵溫度控制在（20±2）℃，定時取樣200 mL于-40℃冰箱中冷凍保存，待分析。待酒精度達到10.5%vol左右時，向發酵液中加入80mg/L的偏重亞硫酸鉀（SO2）終止發酵，并加入400mg/L的皂土澄清、過濾、室溫（20±2）℃灌裝后，酒窖中陳釀3個月，得威代爾冰葡萄酒。

1.3.2 威代爾冰酒基本理化指標測定

還原糖、可滴定酸、pH、酒精度、揮發酸等指標參照國標GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行檢測。

1.3.3 威代爾冰酒中有機酸含量的測定

有機酸含量的測定采用液相色譜法，參考JIN Q等[7]的實驗方法，酒樣在室溫下解凍，混合均勻后，冷凍離心（4℃、6 000 r/min、10 min），用流動相稀釋20倍后過0.22 μm尼龍濾膜，利用液相色譜法進行檢測，色譜柱為TechMate C18-ST（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為21℃。流動相為0.02mol/L磷酸氫二銨，用磷酸調溶液pH值至2.5，等度洗脫，流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL，檢測時間15 min，檢測波長為210 nm。采用保留時間定性，外標法定量。

1.3.4 威代爾冰酒中揮發性香氣成分分析

揮發性香氣成分測定采用氣質聯用法，參照CAIJ等[8]的檢測方法，稍作修改。頂空固相微萃取（HS-SPME）：取5mL酒樣、1gNaCl和10μL內標（4-甲基-2-戊醇，1.280g/L）于15 mL的樣品瓶中，并加入磁力攪拌轉子，立即用帶有聚四氟乙烯隔墊的瓶蓋擰緊，置于磁力攪拌加熱臺上，在40℃條件下平衡30min。隨后將經過活化的PDMS/CAR/DVB三相萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面大約l cm，在40℃條件下加熱攪拌30 min，使樣品瓶中的香氣物質達到氣、液、固三相平衡，然后將萃取頭插入氣相色譜（GC）的進樣口熱解吸8 min。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣口溫度為250℃，氣相色譜升溫程序為：50℃保持1 min，以3℃/min的速度升溫至220℃，載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進樣。質譜條件：質譜接口溫度為280℃，離子源溫度為230℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，質量掃描范圍為29～350 amu。

定性、定量分析：對于有標準物質的，直接采用標準物質進行定性；沒有標準物質的，根據由正構烷烴計算出的保留指數（retentionindex，RI）和質譜信息，結合美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）標準譜庫進行對比，對化合物進行定性；在進行RI計算時，計算得到的RI與標準庫的差值的絕對值＜50時，可定性為該化合物；定量分析時，對于有標準品的物質，利用其在模擬酒溶液中的標準曲線進行定量，無標準品的物質，利用與其化學結構相似、官能團類似、碳原子數相近的標準物質進行定量。

香氣活性值（odouractivityvalue，OAV）計算：是由該物質的含量除以其嗅覺閾值而得到，用以表征揮發性化合物對實際香氣的貢獻大小。其是評價揮發性化合物對實際香氣貢獻大小所普遍采用的一個指標，一般來講，OAV＞1，表示該化合物對葡萄酒香氣有貢獻[10]。雖然目前并沒有關于在冰酒的高糖環境中香氣閾值的文獻報道，但是也可通過采用與普通葡萄酒相近酒精度中的閾值來研究冰酒中的主體呈香物質[11]。

1.3.5 感官評價

從中國農業大學葡萄與葡萄酒專業學生中，篩選出具有一定的品評經驗的20名感官品評員（10男10女），參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，主要從外觀、香氣、口感三個方面，按表1的評分標準給冰酒酒樣打分（滿分為9分）[9-10]。

表1 冰酒感官品評標準Table 1 Sensory evaluation standards of Vidal ice wine

1.3.6數據分析

采用SPSS12.0數理分析統計軟件進行方差分析和主成分分析，采用SigmaPlot 12.0進行統計作圖。

2 結果與分析

2.1 威代爾冰葡萄酒基本理化指標分析

冰葡萄汁和發酵結束后的酒樣的基本理化指標檢測結果見表2。

表2 同時發酵對威代爾冰酒基本理化指標的影響Table 2 Effect of simultaneous fermentation on basic physical and chemical indexes of Vidal ice wine

甘油是酒精發酵的副產物，一般餐酒中甘油含量為1.4～10.6 g/L，而在冰酒的高糖高滲透壓中，酵母往往會代謝產生大量的甘油來保護自己，導致冰酒中的甘油含量增加，本實驗中甘油含量為12.50 g/L左右，這與NURGEL C等[11]的研究結果一致。在加拿大冰酒中，酒精度大約為10.5%vol[11]，本實驗中的酒精含量與其接近。揮發酸是接種乳酸菌的冰酒中值得關注的物質，在高糖的條件下，乳酸菌可能會利用糖異型發酵代謝產生乙酸，從而增加揮發酸的含量[12]。CO-F中稍多的乙酸可能是由于乳酸菌對檸檬酸等物質的代謝，這在一定程度上有助于生成更多的酯類香氣物質，從而賦予冰酒更濃郁的果香[13]。蘋果酸乳酸發酵對冰酒中的還原糖、甘油、酒精度、揮發酸、可溶性固形物等基本理化指標都沒有顯著性的影響，這與前人研究結果一致[14-15]。同時發酵使得總酸顯著降低了0.8 g/L，pH增加了0.07。一般來講，蘋乳發酵會使葡萄酒總酸降低1～3g/L，pH增加0.1～0.3個點[16]。

2.2 不同的發酵方式對冰酒有機酸含量的影響

有機酸在很大程度上決定了葡萄酒的酸度，其種類、濃度以及比例不僅影響著葡萄酒的口感、色澤，還影響著其生物穩定性，因而決定了葡萄酒的類型和品質[6]。采用LC技術對單一酒精發酵和酒精發酵與蘋果酸-乳酸同時發酵的冰酒中有機酸種類和含量進行對比分析，以峰面積（x）為橫坐標，有機酸含量（y）為縱坐標，測定冰酒中各有機酸的保留時間、標準曲線回歸方程、相關系數及其含量見表3。由表3可知，蘋果酸是最主要的有機酸，其含量為有機酸總量的50%。與僅進行酒精發酵的冰酒相比，經過蘋果酸-乳酸發酵的冰酒中蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸含量顯著降低，分別降低26%、26%、23%，乳酸含量顯著增加50%。蘋果酸是一種具有生青味的酸，帶澀味，琥珀酸具有苦味，這兩種酸含量的降低，有利于提高冰酒的口感[15]。乳酸的酸味柔和，其含量的升高有利于冰酒風味質量的提高。蘋乳發酵可以適當地降酸，有利于冰酒品質的提高。

表3 不同發酵方式對威代爾冰酒有機酸含量的影響Table 3 Effect of different fermentation mode on organic acid contents in Vidal ice wine

2.3 不同發酵方式對威代爾冰酒揮發性香氣成分的影響

2.3.1 發酵方式對香氣成分種類和含量的影響

葡萄汁、單一發酵威代爾冰酒和酒精與蘋果酸-乳酸共發酵威代爾冰酒中揮發性香氣物質種類和含量測定及OAV結果見表4。

由表4可知，采用HS-SPME和GC-MS技術，并根據標準物質、RI和質譜信息，結合NIST標準譜庫比對共鑒定出威代爾冰酒58種香氣成分，其中包括醇類20種、酯類19種、酸類5種、萜類9種、其他類5種。

C6醇通常具有生青味，對葡萄酒香氣產生不良影響。與果汁相比，酒樣中的C6醇總量較低。在兩個酒樣中，C6醇總量沒有顯著性的差異，說明在本實驗中蘋乳發酵對冰酒C6類物質影響不大。本實驗中共檢測出了16種高級醇，其中含量較多的有左旋-2,3丁二醇、異戊醇、異丁醇、苯乙醇，分別占高級醇總量的40%、30%、10%和2%，其中苯乙醇給冰酒帶來愉悅的花香和蜜香，形成冰酒典型的香氣特征。蘋果酸-乳酸發酵能顯著降低冰酒中高級醇的總量（12.19%），其中顯著降低了戊醇（呈現出苦杏仁味）的含量，有利于冰酒香氣質量的提高。蘋乳發酵能顯著降低冰酒中高級醇的總量，可能是因為乳酸菌抑制了酵母對氨基酸的利用[13，23]。

表4 葡萄汁及不同發酵方式對威代爾冰酒香氣成分及香氣活度值的影響Table 4 Effect of grape juice and different fermentation modes on aroma components and odor activity value of Vidal ice wine

續表

酯類物質是葡萄酒中僅次于高級醇的第二大類香氣成分，主要包括乙酸酯和乙酯兩大類，是葡萄酒果香最主要的來源，在一定的濃度范圍內可提高葡萄酒的風味品質[24]。與果汁相比，酒樣中的酯類物質含量較高，蘋乳發酵能顯著提高冰酒中酯類物質的含量（34.71%）（P＜0.05）。其中蘋乳發酵中乳酸乙酯含量顯著增加（P＜0.05），其增加主要與前體物質乳酸的形成有關，接入乳酸菌后，乳酸菌會代謝蘋果酸產生乳酸，再與乙醇形成乳酸乙酯，給冰酒帶來果香和奶油香；同時蘋果酸乳酸發酵中辛酸乙酯的含量是單一酒精發酵酒樣的3.2倍，這與前人研究結果相似[25]。

葡萄酒中的揮發性有機酸主要是由發酵過程中微生物（酵母和乳酸菌）代謝產生的，當其濃度過高時，會產生不愉快的酸味和臭味[26]。與果汁相比，酒樣中的有機酸含量較高。本實驗中共檢測到了5種揮發性酸，包括乙酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸。蘋果酸乳酸發酵在一定程度上增加了辛酸、己酸等脂肪酸的含量（12%、9%），可能是因為實驗組在發酵前期乙酸含量較高，從而代謝生成了更多的乙酰輔酶A和脂肪酸輔酶A，最終導致辛酸、己酸等脂肪酸含量增加[13，15]。

萜類物質通常賦予葡萄酒愉悅的果香和花香，雖其含量不大，但由于閾值一般較低，因此對葡萄酒香氣也有較大的貢獻。萜類物質主要來源于葡萄果實，且主要以結合態的形式存在[27]。本實驗中共檢測出了9種萜類物質，共有4種物質的含量大于閾值，包括β-大馬士酮、cis-玫瑰醚、萜品烯、里那醇，賦予冰酒愉悅的果香（荔枝）和花香。蘋果酸乳酸發酵能顯著增加萜類物質的總量（15.2%）。這可能是因為乳酸菌代謝釋放出了糖苷酶，將糖苷態的萜類物質釋放出來，從而增加了游離態萜類物質的總量[28]，提高了冰酒的品質。

2.3.2 不同發酵方式對香氣OAV值的影響

OAV值是評價揮發性化合物對實際香氣貢獻大小所普遍采用的一個指標，一般來講，OAV＞1，表示該化合物對葡萄酒香氣有貢獻[29]。雖然目前并沒有關于在冰酒的高糖環境中香氣閾值的文獻報道，但是也可通過采用與普通葡萄酒相近酒精度中的閾值來研究冰酒中的主體呈香物質[17]。由表3冰酒香氣的OAV值可以得知，冰酒中的主要呈香物質（OAV＞1）總共有20種，其中β-大馬士酮（OAV＞450）是冰酒中最主要的香氣物質，賦予冰酒愉悅的花香，其也被報道是加拿大威代爾冰酒中最主要的香氣物質[29]；cis-玫瑰醚、苯乙醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯等也是冰酒主要的呈香物質，賦予冰酒愉悅的花香、果香、蜜香。發酵結束后冰酒的香氣主要以花香、果香、焦糖香為主，其次為脂肪、泥土、化學、生青味。與發酵前相比，除泥土味外，其余香味在發酵結束后都明顯增加。同時發酵可以明顯提高冰酒的花香、果香，并降低化學味，從而提高冰酒的香氣質量。

2.4 同時發酵對冰酒感官分析結果的影響

對兩種發酵方式的冰酒進行感官評定，采用SigmaPlot 12.0繪制雷達圖，結果見圖1。由圖1可知，在外觀方面，實驗組和對照組基本無差異，均澄清透亮，呈淺黃色帶綠色色調；在香氣方面，兩酒樣均有果香（菠蘿、水蜜桃、青蘋果等）、花香、蜜香、干果香，花香、果香更突出，化學味更低，但是經過蘋乳發酵的香氣更加純正、清新、復雜且奔放；在口感方面，入口均甜潤，經過蘋乳發酵的酒樣酸度更低，甜酸平衡感較好，余味持久，而僅經過酒精發酵的酒樣尾味酸味突出，且略有澀感，平衡感欠佳。綜合評價經過蘋乳發酵的酒樣的整體評分為8分，高于對照組。

圖1 同時發酵（A）與酒精發酵（B）中冰酒感官品評結果雷達圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of ice wine by simultaneous fermentation(A)and alcoholic fermentation(B)

3 結論

以單一酒精發酵的冰酒為對照，在高糖高滲透壓的威代爾冰葡萄汁中同時接種酵母菌和乳酸菌進行同時酒精-蘋乳發酵，結合儀器分析和感官分析對冰酒風味進行綜合評價。結果表明：同時發酵對冰酒中的還原糖、甘油、揮發酸、酒精度等無顯著性的影響，能顯著降低冰酒中的蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸含量，使乳酸含量顯著增加50%；能顯著提高冰酒中酯類物質和萜類物質含量，顯著降低戊醇等高級醇類物質含量（12.19%），能提高冰酒的花香、果香、焦糖香，顯著降低化學味；感官分析結果表明，蘋乳發酵能增加冰酒中的果香、花香，降低冰酒酸度，提高糖酸平衡感，從而提高其整體接受度。綜上所述，同時酒精、蘋乳發酵能改善冰酒的風味，是一種有效降低酸度、提高冰酒質量的方法。