李子果酒主發酵過程中理化指標及揮發性成分變化分析

趙 馳，朱永清，董 玲，黃巧蓮，趙 正，劉 培，何葉正，屈婷敏，李治華*

（四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都 610066）

李子（Prunus salicinaLindl.）別名布霖、嘉慶子，屬薔薇科核果類水果，其果實富含碳水化合物、蛋白質、胡蘿卜素、維生素C、抗壞血酸以及鐵、鈣、磷等多種微量元素[1]，具有降低血壓、止咳、清肺、促進消化、美容養顏等功效[2]。我國李子種植歷史悠久且面積較大，主產區位于西北及長江流域地區，產量位列世界第一[3]。近年來，由于李子不耐貯藏并且種植面積不斷擴大，部分地區出現了“豐產不豐收”的問題，極大的挫傷了果農的積極性。利用發酵工藝對李子進行精深加工，開發李子果酒，不僅能增加果農收入，而且還能夠解決李子不耐貯藏、附加值低的問題。同時發酵型李子酒保留了李子的特有風味和營養成分，且具有低酒精度、低含糖量的特點，兼具保健酒和飲料酒的雙重功效，深受消費者的喜愛。

目前，國內外研究者針對李子果酒的研究非常少，主要集中于發酵工藝、檢測方法及陳釀風味。郭意如等[4]對發酵型李子果酒的部分制作工藝進行了研究，確定了制作李子果酒的最優李子品種、酶制劑和SO2添加量、澄清工藝及發酵溫度；劉永衡等[5]采用溶劑萃取法對陳釀30 d和120 d的幸運李子果酒進行氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用分析，考察了陳釀時間對李子果酒香氣成分的影響。但對于李子果酒發酵過程中理化指標及揮發性物質變化的研究尚未報道。

因此，本研究對李子果酒主發酵過程中的主要理化指標（酒精度、總酸、pH、揮發酸、總糖）進行動態實時監控，并采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術對其揮發性成分進行分析，為提高李子酒的品質和安全提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脆紅李：永輝超市；白砂糖：成都太古糖業有限公司；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；LALLZYME EX-V復配酶制劑、偏重亞硫酸鉀、氫氧化鈉、重鉻酸鉀、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、硫酸、磷酸：成都市飛騰博川生物公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計：深圳天溯計量檢測有限公司；CP153分析天平：奧豪斯儀器有限公司；SPME Fiber（75μm）：上海安普實驗科技有限公司；Agilent9000GC/5977BMSD氣相色譜質譜聯用儀、DB-WAXUI色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 李子果酒制備工藝流程及操作要點

原材料選擇及預處理→酶解→調整成分→主發酵→過濾→澄清→陳釀→成品

操作要點：

原材料選擇及預處理：選取新鮮、飽滿、無病蟲害的李子果實，用流動清水進行清洗，然后去核破碎打漿。

酶解：向李子果汁中加入0.03 g/L復配酶制劑，以提高李子果漿出汁率和澄清效果。

調整成分：向李子果汁中加入180 g/L白砂糖[4]；加入0.1 g/L偏重亞硫酸鉀，以抑制雜菌。

主發酵：將干酵母加入40℃溫水中進行活化，在李子果漿中加入0.2 g/L活化酵母，將發酵罐置于26℃條件下發酵7 d，期間進行攪拌使其完全發酵。

過濾、澄清及陳釀：發酵7 d后，采用0.4 g/L的皂土進行下膠處理，將酒液通過紗布和硅藻土進行過濾并移至新的發酵罐中于20℃陳釀2個月[6-7]。

1.3.2 樣品收集

將酵母接入李子果漿的時間計為發酵第1天，李子果酒主發酵周期一般為7 d，因此，在李子果酒發酵第1、2、3、4、5、6、7、8天進行取樣，所有采集樣品均經過4層紗布過濾后進行分析。

1.3.3 理化指標的測定

參照國家標準GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對李子果酒樣品的酒精度、總糖含量、總酸含量及揮發酸含量進行測定；采用pH計測定pH值。

1.3.4 揮發性成分分析

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀對李子果酒中的揮發性成分進行測定。

參照張晶等[8]的方法，并略作修改。在20 mL頂空瓶內加入10 mL李子果酒樣，45℃條件下平衡10 min，將萃取頭插入頂空瓶中于45℃條件下萃取40 min后拔出，插入氣相色譜儀進樣口，230℃條件下解吸5 min。

GC條件：載氣為氦氣（He），流速1 mL/min；無分流進樣；程序升溫：起始溫度35℃，維持3 min；以6℃/min升至150℃，維持1 min；然后再以12℃/min升至230℃，維持3 min。

MS條件：電離方式為電子電離（electronionization，EI）；電子能量為70eV；離子源溫度為230℃；接口溫度為280℃；質量掃描范圍為20～550 u。

定性定量分析：對GC-MS得到的李子果酒質譜數據與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）11標準譜庫進行檢索，并結合保留指數進行定性分析；采用面積歸一化法確定各揮發性物質的相對含量[9-11]。

2 結果與分析

2.1 李子果酒主發酵過程中總酸含量和pH值的變化

李子果酒發酵過程中總酸含量和pH值的變化過程如圖1所示。

圖1 李子果酒主發酵過程中總酸含量和pH值的變化Fig.1 Changes of total acid content and pH of plum fruit wine during main fermentation process

由圖1可知，在李子果酒主發酵過程中，隨著發酵時間的延長，總酸含量呈現先逐漸下降后趨于穩定的趨勢，當發酵1～4 d時，總酸含量由10.13 g/L下降至10.00 g/L；當發酵4～6 d時，總酸含量下降速度加快，從10.00 g/L下降至9.10 g/L；當發酵7～8 d時，總酸含量趨于穩定，主發酵結束，總酸含量為9.13 g/L。pH值變化與總酸含量變化趨勢相反，當發酵1～5 d時，pH值由3.67上升至3.75；當發酵5～8 d時，pH值趨于平穩，到主發酵結束時達到3.76。

2.2 李子果酒主發酵過程中酒精度和總糖含量的變化

李子果酒主發酵過程中酒精度和總糖含量的變化情況不僅反映出酵母菌對糖分的利用和酒精的產生情況，也是體現李子果酒發酵進程的重要標志[12]，其變化情況見圖2。

圖2 李子果酒主發酵過程中酒精度和總糖含量的變化Fig.2 Changes of alcohol content and total sugar content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖2可知，在李子果酒主發酵過程中，隨著發酵時間的延長，總糖含量呈先下降后趨于穩定的趨勢，酒精度則相反。當李子果酒發酵1～5 d時，總糖含量迅速下降，從186.47 g/L下降至22.79 g/L，酒精度迅速上升，從0快速增加至11.90%vol。發酵5 d之后，總糖含量逐漸趨于平穩，而酒精度則緩慢下降。發酵8 d時，總糖含量為22.90 g/L，酒精度為11.10%vol。

2.3 李子果酒主發酵過程中揮發酸含量的變化

揮發酸是評價果酒品質的重要指標，揮發酸含量過高會改變酵母的發酵能力，造成發酵異常，同時會對果酒口感產生較大影響，帶給人醋味和尖酸感[13]。其變化情況見圖3。

圖3 李子果酒主發酵過程中揮發酸含量的變化Fig.3 Changes of volatile acid content in plum fruit wine during main fermentation process

由圖3可知，在李子果酒發酵過程中，隨著發酵時間的延長，揮發酸含量呈逐漸上升趨勢，當李子果酒發酵1～2 d，揮發酸含量快速上升，從0.07 g/L上升至0.17 g/L；當發酵2～6 d，揮發酸含量雖逐漸增加，但上升速度變緩；當發酵6～8 d，揮發酸含量又快速升高，發酵8 d時，揮發酸含量為0.25 g/L。

李子果酒發酵過程中，pH值、總酸含量、酒精度、總糖含量以及揮發酸含量的變化與李子果酒的發酵程度和品質密切相關。在發酵過程中，總糖和總酸含量呈下降的趨勢，pH值、酒精度及揮發酸含量呈上升趨勢，究其原因，可能是由于發酵前4天，微生物處于快速生長繁殖階段，其代謝活動劇烈，使揮發酸含量快速上升[13]，并迅速利用李子果酒中的糖類物質轉化為乙醇，從而導致果酒中酒精含量快速增高，而糖類物質含量迅速下降。隨著發酵進程的持續進行，酵母菌可利用的糖類物質變少，同時酒精含量的增加也會對酵母菌的生長和活動產生抑制作用，造成酵母菌分解糖類物質速率降低，酒精度和總糖含量趨于平穩。發酵后期酒精度略微降低是由于乙醇和酰基輔酶A在釀酒酵母細胞內被醇酰基轉移酶催化生成相應的酯類造成的[14]。總酸含量降低是由于一些酸類物質在微生物的作用下被分解及利用，如乙酸乙酯的合成途徑，酵母在酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯，從而導致總酸含量逐漸降低、pH值升高，而揮發酸含量在主發酵后期依舊呈現出緩慢上升的趨勢，所以在之后陳釀過程中需要對陳釀環境以及儲藏管理加大控制力度，避免揮發酸含量持續增高對李子果酒口感和品質造成負面影響[15]。

2.4 李子果酒主發酵過程中主要揮發性物質變化

揮發性物質是果酒風味的重要指標[16-17]，其主要來源于水果本身、微生物代謝以及陳釀過程，通過HS-SPMEGC-MS檢測及NIST數據庫對比發現，李子果酒主發酵過程中主要物質是醇類和酯類物質，其中主要變化的醇類物質有乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，其變化過程見圖4。

圖4 李子果酒主發酵過程中醇類物質的變化Fig.4 Changes of alcohols in plum fruit wine during main fermentation process

由圖4可知，在李子果酒發酵過程中，隨著發酵時間的延長，乙醇、異戊醇、異丁醇的相對含量呈先升高再下降后趨于穩定的趨勢；苯基乙醇的相對含量呈先升高后趨于穩定的趨勢；1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對含量呈先下降后趨于穩定的趨勢。主發酵結束后，乙醇、異戊醇、異丁醇、苯基乙醇、1-己醇、順式-3-己烯-1醇的相對含量分別為51.79%、15.74%、4.46%、1.47%、2.09%、0.71%。

主要變化的酯類物質有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，其變化過程見圖5。

圖5 李子果酒主發酵過程中酯類物質的變化Fig.5 Changes of esters in plum fruit wine during main fermentation process

由圖5可知，在李子酒發酵過程中，隨著發酵時間的延長，乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對含量均呈逐漸升高的趨勢；而3-甲基-1-丁醇乙酸酯和乙酸己酯的總體趨勢則表現為先上升后下降。主發酵結束后，乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相對含量分別為3.91%、4.59%、7.46%、0.75%、3.14%、2.86%。

香氣成分是李子果酒品質的重要組成部分，6種醇類物質中1-己醇、異戊醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇這4種醇類物質各自具有獨特風味特征，如1-己醇具有水果芬芳的誘人香氣，異戊醇為國家規定的食用香精，苯基乙醇具有花香；6種主要的酯類物質也是李子果酒香氣構成的重要成分，如辛酸乙酯具有白蘭地酒香味，主要用于調味品、香料制造，癸酸乙酯和乙酸異戊酯均可用于調香[18-23]。

3 結論

本研究以李子為原料制作李子果酒，在李子果酒主發酵過程中，隨著發酵時間的延長，pH值、酒精度呈先升高后趨于穩定的趨勢；總酸、總糖含量呈先下降后趨于穩定的趨勢；揮發酸含量呈上升趨勢。主發酵結束后，李子果酒的酒精度為11.10%vol、總酸含量為9.13 g/L、pH值為3.76、揮發酸含量為0.25 g/L、總糖含量為22.90 g/L。李子果酒發酵過程中主要的揮發性物質為醇類和酯類，主要變化的醇類包括乙醇、1-己醇、異戊醇、異丁醇、順式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，主要變化酯類包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯。本研究揭示了李子果酒發酵過程中理化指標和揮發性物質的變化規律。