響應面法優化純種根霉米粉種曲制作工藝

吳 健，祝 賀，2，藍彩紅，劉盛鋼，賀燕波，郝哲兵，楊 濤，*

（1.中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410000；2.山東農業工程學院食品科學與工程學院，山東 濟南 250100；3.華澤集團有限公司，云南 迪慶 674400）

小曲酒是以小曲為糖化發酵劑進行釀造的中國傳統白酒，因其使用的酒曲以及發酵方式的不同而有別于大曲酒，在酒行業中占據著一定的市場。傳統小曲的制備是以自然接種的方式，在觀音土、米糠、薯渣、米粉、麩皮等制曲原料上培養得來，相關微生物主要有根霉、曲霉、毛霉等霉菌以及酵母菌等，培養過程中也會有細菌生長，整個制曲工藝中對有益微生物和有害微生物的生長難以把控[1-2]。隨著純種培養技術的發展，小曲的制作逐漸改進為純種接種根霉培養種曲，與酵母菌混合制曲，出酒率大大得以提高，如廈門白曲，邛崍米曲等小曲，其中根霉是小曲制作中的主要糖化菌，含有豐富的糖化型淀粉酶，能從釀酒原料中淀粉的非還原端切斷α-1,4和α-1,6糖苷鍵，使其轉化成為可發酵性還原糖，供后續發酵微生物利用[3]，在整個釀造過程中起著至關重要的作用，同時成品曲的糖化性能是檢驗酒曲質量的重要指標，也是影響白酒釀造出酒率的關鍵因素之一。

純種根霉曲的生產包括一級試管種培養，二級三角瓶種曲制作，然后再擴大培養到三級淺盤種曲，后續大批投入培養成生產曲[4-5]，目前關于純種根霉米粉曲的研究主要集中在生產曲生產過程中的酶學性質研究及工藝優化[6-7]，機械化制曲的工藝摸索[8]，以及菌種的改造選育與表達分析[9-11]。未有針對一級試管菌種與種曲質量的相關性研究，其培養多憑靠經驗判斷，難以穩定，但實際上一級試管菌種的狀態會直接影響到二級種曲制作的質量，與后續生產曲的發酵特性密切相關，是整個制曲過程中的關鍵環節。培養時間過短會使得糖化性能變差，發酵不能正常進行；若培養時間過長，過多的孢子會導致成品酒出現不好的風味。而酒曲作為釀酒的糖化發酵劑，其質量好壞很大程度上決定了釀造過程能否正常發酵，沒有針對性的工藝研究，常常會導致不必要的人力物力損失，因此很有必要對米粉種曲制作工藝進行探究與優化。

種曲的糖化性能好壞決定了后續生產曲的優劣，針對該指標展開研究，對實際生產具有很大的指導作用。采用純種根霉接種制備種曲，通過控制一級試管菌種的培養時間、種曲培養溫度以及米粉的水分含量，研究三者對種曲試飯糖分值與糖化酶活力的影響，并利用Box-Behnken響應面設計進一步對種曲制作工藝進行優化，以期為根霉制曲自動化，智能化的發展建設提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

WJ02-G根霉：桂林湘山酒業有限公司；國家一級秈米：湖南省金健米業股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

苯酚、酒石酸甲鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosali cylic acid，DNS）、瓊脂粉：生工生物工程（上海）股份有限公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、冰醋酸、醋酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

米曲汁瓊脂培養基：參照毛宜祥等[12]的方法制備，再以純水調節其糖度至12°Bx，以氫氧化鈉溶液調節pH至6.5，瓊脂添加量為2%，115℃條件下高壓滅菌20 min，斜面擺至試管長度1/3，放置10 d待試管內壁無水珠后備用。

1.2 儀器與設備

60目標準篩：新鄉市同心機械有限責任公司；SF130高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區中南制藥機械廠；LMQ電熱立式自動高壓滅菌鍋：山東新華醫療器械股份有限公司；SW-SJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；MJP-250霉菌培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；DZ-260C真空包裝機：溫州市凱馳包裝機械有限公司；HH-M2恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭試驗儀器廠；UV-1800紫外可見光分光光度計：島津企業管理有限公司。

1.3 方法

1.3.1 純種根霉米粉種曲制作工藝流程及操作要點

操作要點：將秈米粉碎后過60目標準篩，以每瓶40 g的裝載量將米粉分裝在500 mL三角瓶中，于121℃條件下15 min后取出趁熱用無菌藥刮攪散待冷卻至室溫，同時在無菌水中加入1 mL試管根霉菌懸液，混勻后將混合液倒入冷卻刮散的米粉中翻拌均勻，然后旋轉搭窩，置于32℃霉菌培養箱培養24h后扣瓶，繼續培養至48h后將米粉餅取出放入無菌牛皮紙袋內，于39℃電熱鼓風干燥箱中干燥48 h后真空包裝，待測種曲的糖化酶活力及試飯糖分。

1.3.2 不同培養時間試管菌種的菌懸液制備

無菌操作勾取WJ02-G純種根霉菌絲體接種于米曲汁瓊脂培養基斜面中間，于32℃霉菌培養箱中培養一定時間，培養結束后將試管中根霉整塊挑出置于無菌研缽中，加入3 mL無菌水研磨2 min，制得不同培養時間試管菌種的菌懸液。

1.3.3 酒曲糖化酶活力的測定方法

糖化酶活力定義[13]：1 g酒曲（以絕干計）在40℃、pH 4.6條件下，1h分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，以U/g表示。

測定方法：參照馬歌麗等[14]的方法利用3,5-二硝基水楊酸比色法測定種曲中的糖化酶活力。

1.3.4 酒曲試飯糖分的測定方法

試飯方法：參照王曉慧等[15]的方法，糖分：參照馬歌麗等[14]的方法利用DNS法進行定量。

1.3.5 單因素試驗

設置各因素的固定水平分別為試管菌種培養時間72h、種曲培養溫度32℃、米粉水分含量25%。改變待考察因素的水平分別為試管菌種培養時間36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h；種曲培養溫度26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃；米粉水分含量15%、20%、25%、30%、35%、40%。培養完畢后分別測定種曲的試飯糖分與糖化酶活力。

1.3.6 Box-Behnken響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以試管菌種培養時間（A）、種曲培養溫度（B）、種曲水分含量（C）為考察因素，以試飯糖分（Y）為響應值，利用Box-Behnken響應面設計試驗，試驗因素與水平如表1所示。

表1 種曲制作工藝優化Box-Behnken響應面設計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface design for optimization of rice flour fermentation process

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1不同培養時間的一級試管菌種對種曲的影響

圖1 培養時間對種曲的影響Fig.1 Effect of culture time on the seed starter

由圖1可知，當培養溫度為32℃、米粉水分含量為25%時，不同的試管菌種培養時間對種曲的糖化酶活力與試飯糖分值均有顯著影響。在36～72h時，隨著培養時間的延長，糖化酶活力與試飯糖分值呈現遞增趨勢，在72 h均達到了峰值，分別為698.13 U/g和25.02 g/100 g；延長時間繼續培養，72 h之后兩者均逐漸降低。

這一現象很有可能與根霉菌絲生長與孢子產生直接相關，根霉菌絲是根霉營養體的基本單位，隨著頂端的細胞不斷生長而蔓延開來逐漸成熟，是由孢子在合適的生長條件下萌發得來，但成熟的根霉菌絲同樣具有繁殖能力與糖化能力[16]，往往孢子較少而菌絲較多的根霉曲，接種后有利于根霉孢子的萌發和菌絲體的前期生長。隨著試管菌種中菌絲體逐漸成熟到最終老化，以及孢子數量不斷增多，接種后種曲的糖化酶活力與試飯糖分值均呈現出先升后降的趨勢。因此，選擇72 h為最適宜的試管菌種培養時間。

2.1.2 不同的培養溫度對種曲的影響

圖2 培養溫度對種曲的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the seed starter

由圖2可知，在試管菌種培養時間為72 h、米粉水分含量為25%的條件下，不同的培養溫度對于種曲的糖化酶活力與試飯糖分同樣影響顯著。在26～34℃范圍內，糖化酶活力隨種曲培養溫度的升高持續增高，在34℃達到峰值753.80 U/g，之后隨溫度升高而出現急劇下降；26～32℃范圍內，試飯糖分隨溫度升高，在32℃達到峰值26.33 g/100 g，超過32℃后逐漸下降。兩者總體趨勢均呈現為先升后降，但糖化酶活力34℃時最優，試飯糖分在32℃最優，同時兩者下降的幅度是前者大于后者。

大部分根霉的最適生長溫度為30～33℃，而產酶溫度則比生長溫度稍高，最適產酶溫度在30～35℃[17]，根霉在適宜溫度條件下快速生長，然后在合適的產酶溫度下開始產酶；IKASARI L等[18]研究發現，溫度上升會導致根霉在生長過程中主動延長的菌絲尖端數量減少，而且將溫度降低之后，根霉也并不會立即恢復。超出最佳生長溫度范圍之外后，根霉的生長會被抑制，孢子的萌發和菌絲體的生長也會隨之受限。因此根霉產酶會受到很大的影響，酶活急劇下降。相對而言，溫度對試飯糖分的影響比糖化酶活力小一些，針對試飯糖分開展研究。因此，選擇32℃為最適宜的種曲培養溫度。

2.1.3 不同的水分含量對種曲的影響

圖3 米粉水分含量對種曲的影響Fig.3 Effect of moisture content of rice flour on the seed starter

由圖3可知，在試管菌種培養時間為72 h，種曲培養溫度32℃條件下，米粉中不同的水分含量對種曲糖化酶活力及試飯糖分都影響顯著。在15%～25%加水量范圍內，試飯糖分值隨水分含量的增大而逐漸升高，在25%處達到峰值27.23 g/100 g，在25%～40%范圍內，試飯糖分值隨水分含量的增加而持續降低；糖化酶活力與試飯糖分值趨勢相同，但峰值點出現在30%處，為713.67 U/g，在15%～30%范圍遞增，30%～40%范圍遞減，且下降幅度較大。

水分和氧氣是影響根霉生長代謝的重要因素，米粉中的水分一方面為根霉生長提供了必須的條件，另一方面也影響著根霉生長環境的氧含量，從而調控著其生長。SPARRINGA R A等[19]在對寡孢根霉菌進行生長條件優化時發現其生長需要一定的水分，劉憲春[20]在研究根霉Q303生長特性時也發現，水分與溫度是影響根霉質量的關鍵因素，而且根霉在培養過程中也需供給一定量的氧分，以提高培菌糖化率和出酒率[21]。水分含量適宜時，根霉可以從生長環境中獲取足夠的水與氧氣，但當水分過多時，物料疏松程度不夠，米粉過多粘結成塊，氧濃度不足的同時，也阻礙了根霉菌絲的攀附延伸，對其生長不利。從試飯糖分的結果來看，選擇25%作為最適宜的加水量較為合理。

2.2 Box-Behnken響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面設計及結果

小曲酒的釀造工藝決定了小曲的添加量遠遠小于大曲，后續的發酵主要依靠菌體邊生長邊糖化發酵，酒曲的糖化酶活力并不是決定糖化好壞的關鍵因素，試飯糖分值更能準確地反映出實際發酵過程中酒曲的糖化性能。在單因素試驗的基礎上，以試管菌種培養時間（A）、種曲培養溫度（B）、米粉水分含量（C）為試驗因素，試飯糖分值（Y）為響應值，利用Design Expert 8.06響應面軟件的Box-Behnken設計3因素3水平試驗，試驗設計與結果見表2。對試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到試飯糖分Y對自變量A、B、C的回歸方程為：

表2 種曲制作工藝優化響應面試驗結果與分析Table 2 Analysis and results of Box-Behnken response surface design for optimization of rice flour fermentation process by pure Rhizopus seed starter

2.2.2方差及可信度分析

響應面的二次模型方差分析結果見表3，由表3可知，模型的P值＜0.001，差異極顯著，具有統計學意義；失擬項P值＞0.05，差異不顯著，說明所選模型與試驗的擬合度較好，可用該回歸方程對試驗結果進行分析。一次項中A（菌種時間）、B（培養溫度）、C（水分含量）的P值分別為PA＜0.001，0.001＜PB＜0.05，PC＜0.05，三者P值均＜0.05，表明3個因素均對響應指標試飯糖分具有顯著影響，其中A影響極顯著，B、C影響顯著。F值越大，則試驗因素對響應指標的影響程度越大，三者F值分別為31.32、6.95、24.66，表明3個因素對試飯糖分的影響程度大小為A＞C＞B。二次項A2、B2、C2對試飯糖分均有極顯著影響（P＜0.01）。

表3 響應面二次模型的方差分析結果Table 3 ANOVA results of response surface quadratic model

方差分析結果中，決定系數R2值為0.99，表明模型可以解釋99%的響應值，回歸方程的擬合程度較好；調整決定系數R2值為0.98，說明試驗可進行優化，調整之后有98%的變化來源于試驗所考察變量。變異系數為2.14%，在試驗范圍內變異較小，數據的離散程度在可接受范圍內。

綜上，回歸模型與實際值的擬合程度較好，可用來預測和優化純種根霉米粉種曲制備的工藝。

2.2.3 各因素交互作用的響應面分析

各因素交互作用對種曲試飯糖分值的影響如圖4所示。等高線的形狀可反映出交互作用的顯著性，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，等高線呈圓形表示交互作用不顯著；若響應面坡度相對平緩，表明處理條件的變化對響應值的影響不大，相反，如果一個響應面坡度陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感[22]。由圖4可知，隨著3個因素的水平逐漸增高，種曲試飯糖分值呈現出先增后降的趨勢，交互作用的3個響應面均出現極大值。圖4的陡峭程度顯示：A（菌種時間）、B（培養溫度）、C（水分含量）均對響應指標試飯糖分值有顯著影響，其中BC（水分含量與培養溫度）的交互作用相對較強，對試飯糖分值的影響相對較大。以上結果與響應面二次模型方差分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對種曲試飯糖分值影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the trial sugar content of rice testing

2.3 最佳工藝驗證試驗

針對Box-Behnken響應面優化過后得出的最佳工藝開展驗證試驗：一級試管菌種培養時間為73 h，種曲培養溫度為32℃，水分含量為26%，重復3次，實際試飯糖分平均值為27.18 g/100 g，與模型預測的理論優值27.74 g/100 g基本一致，模型擬合成功，優化工藝能為根霉種曲的生產提供依據。

3 結論

本試驗以試管菌種培養時間、種曲培養溫度、米粉水分含量為試驗因素，以種曲的試飯糖分值為響應指標，利用響應面法建立了純種根霉種曲制作工藝的二次項回歸模型，通過方差分析，驗證了該模型的預測優值與實際值的擬合程度較高。在此基礎上，針對試飯糖分值做了最大值優化，得出優化工藝為一級試管菌種培養時間為73 h，種曲培養溫度為32℃，水分含量為26%，在此條件下的重復驗證試驗顯示，試飯糖分值為27.18 g/100 g，與模型預測的理論優值27.74g/100g基本一致。該模型優化工藝能為根霉種曲的生產提供參考。