利用金銀花蒸餾殘液生物轉化綠原酸工藝優化

張楓源，代珍珠，向 福，2*，李俊賢，謝 實

（1.黃岡師范學院 經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

金銀花（Lonicerae japonica Thunb）是隸屬于忍冬科植物的干燥花蕾，被譽為“國寶一枝花”，其有效成分主要為綠原酸等有機酸類化合物、木犀草苷等黃酮類化合物，以及揮發油、三萜類化合物等活性物質[1]，在臨床上能起到解毒、抗炎、降血脂、調節免疫等作用[2]。

羅田縣位于湖北省東北部，地處大別山，氣候環境適宜，山地丘陵隨處可見野生金銀花，具有很好的金銀花資源開發潛能[3]。“羅田金銀花”由于具有濃郁的香氣和較高含量的綠原酸等活性成分，被評為“中國地理標志產品”[4-5]。“羅田金銀花”從2011年開始大面積種植，目前種植規模已超過2萬畝，加速了羅田縣金銀花露加工產業的發展。金銀花露加工過程中產生大量的蒸餾殘液，其中雖然含有綠原酸等金銀花的主要活性物質[6]，但由于深加工不足，本地企業多是直接排放，不僅造成巨大的資源浪費，也對環境造成污染。

綠原酸是一種酚類化合物，易溶于水、醇、丙酮等[7]，是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗輻射、提高白細胞數量、補腎、增強免疫調節等能力[8-12]。生物轉化又稱為生物催化，是依據各種選擇性催化生成相應的產物[13]，其中涉及到糖基化、環氧化、水解等一系列反應[14-15]。微生物轉化植物次生代謝產物近年來逐漸受到人們關注[16]，特別是在中藥活性物質的轉化合成方面表現出良好的應用前景[17-19]。目前對綠原酸轉化的研究多是篩選內生真菌來提高其產量或利用微生物對其進行分解[20-22]，有關菌株轉化金銀花中綠原酸的研究較少。

本文擬通過篩選轉化綠原酸的優勢菌株，探討其用于發酵轉化金銀花蒸餾殘液中綠原酸的優化條件，從而為地方金銀花露加工企業提供一種簡單有效的蒸餾剩余物資源化利用工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花蒸餾殘液：湖北楚天舒藥業有限公司蒸餾剩余物過濾后制得備用；黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）：本校微生物實驗室。

氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；綠原酸標準品（純度≥95%）：天津市天力化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；酵母抽提物、蛋白胨（生化試劑）：天津市大茂化學試劑廠。

察氏培養基[23]：取蔗糖30 g，瓊脂20 g，NaNO33.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5g，蒸餾水1L，pH自然。

1.2 儀器與設備

HYG-B型全溫度搖瓶柜：太倉市實驗設備廠；YX280/15壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；Ax-205 METTLERTOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團；精密試紙：上海三愛思試劑有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；H/T18MM型臺式高速離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；Varian Cary100Scan型紫外可見分光光度計：美國Varian公司；SB25-12DTDN型超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸標準曲線繪制及樣品中綠原酸含量計算

根據文獻[24]，準確稱量6.20 mg綠原酸標準品，反滲透水定容到100 mL容量瓶中，搖勻備用。用移液槍吸取0、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL的綠原酸標準品溶液于10 mL容量瓶內，以不加綠原酸標準品溶液的一組作為對照，掃描確定最大吸收波長為320 nm，以吸光度值（A）為縱坐標，綠原酸質量濃度（C）為橫坐標，得到綠原酸標準曲線回歸方程為A=58.721C-0.119 9，R2=0.999 4，表明綠原酸在0.006 2～0.0310mg/mL范圍內的質量濃度與吸光度值呈現良好的線性關系。

按上述方法在波長320 nm處測定樣液的吸光度值，并計算綠原酸質量濃度，利用公式（1）計算綠原酸增量：

其中，E為綠原酸增量，μg/mL；C樣液為三個平行試驗發酵液樣品中綠原酸質量濃度，mg/mL；C母液為三個平行樣品所對應的未經菌液發酵的混合液中綠原酸質量濃度，mg/mL；V為液體發酵液的體積，mL。

1.3.2 菌株的篩選

實驗選取的菌種分別為枯草芽孢桿菌和黑曲霉，將菌擴大培養（細菌培養16～18 h，黑曲霉培養3 d），將培養的菌按1∶2（V∶V）的比例加入滅完菌的含有察氏培養基和金銀花蒸餾剩余物的錐形瓶中，做三個平行組以及一個對照組，再將其放入搖床30℃、150 r/min條件下培養6 h，培養結束后，將其取出高速離心，取上清液，測定吸光度值，計算綠原酸含量。

1.3.3 單因素試驗

總加入體積為150 mL，取培養基30 mL于250 mL三角瓶，剩余120 mL按一定接種量繼續加入，分別以發酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、發酵時間（4h、6h、8h、10h、24 h）、接種量（0.58×107CFU/mL、0.72×107CFU/mL、0.96×107CFU/mL、1.44×107CFU/mL、1.92×107CFU/mL）、搖床轉速（0、50 r/min、100 r/min、150 r/min和200 r/min）為變量，考察各因素對金銀花蒸餾殘液中綠原酸含量的影響。

1.3.4 正交試驗

選取發酵時間（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和轉速（D）四個單因素，設計如表1所示的L9（34）正交試驗，優化發酵轉化金銀花蒸餾剩余物中綠原酸的工藝。

表1 生物轉化條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for biotrans formation conditions optimization

1.3.5 數據分析

利用Microsoft Excel 2003和正交設計助手等軟件進行試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

兩種菌株轉化綠原酸結果如表2所示，兩種菌株都能增加金銀花蒸餾剩余物中綠原酸含量，其中以枯草芽孢桿菌的轉化能力最強，綠原酸含量增加135.33 μg/mL，顯著高于黑曲霉的轉化能力（P＜0.05）。因此，轉化菌株宜選枯草芽孢桿菌。

表2 兩種菌種對綠原酸含量的影響Table 2 Effect of two strains on chlorogenic acid content

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 發酵溫度對綠原酸增量的影響

發酵溫度是影響菌體生長發育、代謝最直接的因素，考察發酵溫度對綠原酸增量的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，當發酵溫度20℃增加至30℃時，綠原酸增量增加到峰值，其后隨著發酵的溫度上升，增量顯著降低（P＜0.05）。可能是溫度超過30℃后，不適宜枯草芽孢桿菌的生長和代謝而影響菌株的活性[25]，代謝和轉化綠原酸的能力隨之減弱。因此，發酵溫度以30℃為宜。

圖1 發酵溫度對綠原酸增量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on chlorogenic acid increment

2.2.2發酵時間對綠原酸增量的影響

考察發酵時間對綠原酸增量的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，發酵4～6 h時，綠原酸的增量升高，延長發酵時間到8 h，綠原酸增量急劇下降。原因可能是隨著菌體的生長，營養物質不斷的消耗，產生了較多的代謝物質，抑制菌株的生長代謝。因此，發酵時間以6 h為宜。

圖2 發酵時間對綠原酸增量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on chlorogenic acid increment

2.2.3接種量對綠原酸增量的影響

考察接種量對綠原酸增量的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著接種量的減小，金銀花蒸餾剩余物中的綠原酸增量呈先增加后減少的趨勢，在1.44×107CFU/mL時達到最大值，為（79.70±4.77）μg/mL，可能是由于接種量減少后，枯草芽孢桿菌菌液少，不能及時轉化綠原酸，反而被抑制而使綠原酸含量負增長。故以接種量以1.44×107CFU/mL為宜。

圖3 接種量對綠原酸增量的影響Fig.3 Effect of inoculum on chlorogenic acid increment

2.3.4轉速對綠原酸增量的影響

枯草芽孢桿菌發酵受溶氧水平影響，考察轉速對綠原酸增量的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，隨著轉速的加快，金銀花蒸餾剩余物中的綠原酸增量不斷增大，直到轉速為150r/min時，增量增加到峰值。之后，隨著轉速的增加，綠原酸增量下降趨勢明顯。這是由于轉速加快，增大了溶氧量，使菌株的代謝能力增強，綠原酸增量隨之增加。超過150 r/min后，溶氧量雖然增大了，但是發酵液中的剪切力也與之增大，對菌株可能有損傷，影響生長代謝。故選擇轉速150 r/min為宜。

圖4 轉速對綠原酸增量的影響Fig.4 Effect of rotating speed on chlorogenic acid increment

2.4 正交優化試驗結果

以發酵時間（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和轉速（D）四個因素設計的L9（34）正交優化試驗結果和方差分析分別如表3和表4所示。

表3 生物轉化條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for biotrans formation conditions optimization

續表

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

根據表3～表4的正交優化試驗結果，4個因素對枯草芽孢桿菌轉化金銀花蒸餾殘液中綠原酸的影響程度為C＞A＞D＞B，即影響最大的因素為發酵溫度，其次為發酵時間，搖床轉速和接種量則影響相對較小；由表3可知，發酵轉化的優化工藝為A3B2C1D2，即發酵溫度25℃，發酵時間8 h，轉速150 r/min，接種量1.44×107CFU/mL。

2.5 驗證試驗

根據優化工藝條件，平行試驗3次，綠原酸增量為（193.03±47.60）μg/mL，高于表3中綠原酸最高增量（191.67±39.25）μg/mL，表明正交試驗所確定的優化條件可作為枯草芽孢桿菌轉化金銀花蒸餾剩余物中綠原酸的最佳工藝。

3 結論

以實驗室的枯草芽孢桿菌作為優勢菌株，可用于轉化提高地方企業金銀花露加工蒸餾剩余物中的綠原酸含量，其最佳發酵工藝為發酵溫度25℃，發酵時間8 h，轉速150 r/min，接種量1.44×107CFU/mL。此時，金銀花蒸餾剩余物中枯草芽孢桿菌轉化綠原酸增量可達（193.03±47.60）μg/mL。該方法可用于工業化生產，從而為地方金銀花露加工企業提供了一種簡單有效的蒸餾剩余物資源化利用工藝。