蟲草花多糖提取工藝優化及其抗氧化特性

王振吉，楊申明*，許云香，周林宗

（楚雄師范學院 化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

蟲草花（Cordyceps militaris）隸屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps），又稱蟲草子實體、不老草、蛹蟲草等[1-2]?！跋x草花”不是蟲、不是草、也不是花，它是一種人工培養的蟲草子實體，屬蟲、菌結合的真菌類[3]。蟲草花中富含蛋白質、氨基酸以及蟲草素、甘露醇、多糖等多種活性物質[4]，對于增強體內巨噬細胞功能、調節人體免疫力、提高人體抗病能力具有一定的功效。

多糖是一類大分子物質，具有多種重要生物活性，如抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、降血糖血脂[8]、調節免疫力[10]等作用，因此被廣泛應用于食品、發酵、醫藥和化妝品等領域。張素斌等[11]用熱水提取法、單一酶法、超聲波法對蟲草花多糖進行提取，并比較幾種提取方法的提取條件，在最佳提取條件下，熱水提取法、纖維素酶法、木瓜蛋白酶法和超聲波法的多糖提取率分別為18.12%、15.01%、18.57%、13.34%；賈有青等[12]用超聲波法提取蟲草花多糖，確定了蟲草花多糖較佳提取條件為料液比1∶40（g∶mL），超聲時間30 min，超聲溫度50℃，在此條件下測得蟲草花多糖提取率為4.85 g/100 g；李銀花等[13]采用正交試驗優化了超聲輔助提取蟲草花多糖的工藝條件為：超聲溫度80℃，超聲功率140 W，超聲時間為40 min，在此條件下測得蟲草花多糖提取率為3.46%。

本研究以蟲草花為試驗材料，實驗室自制蒸餾水為提取溶劑，在考察單因素超聲功率、液料比、超聲時間、超聲溫度試驗的基礎上，通過L9（34）正交試驗優化超聲波輔助提取蟲草花多糖的工藝條件；同時以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，就蟲草花多糖對于·OH、1,1-苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrlhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用和還原能力進行研究，以期為深入研究蟲草花多糖特性，進一步開發和利用蟲草花中多糖類物質提供理論依據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟲草花（Cordyceps militaris）：采自云南省楚雄市東華鎮。蟲草花依次用自來水、蒸餾水洗凈、曬干，粉碎后過40目篩，得干粉。干粉經石油醚脫脂、脫色素處理后，50℃烘干，得去除色素和油脂的干粉，保存，備用。

葡萄糖標準品（純度≥98%）：天津市優譜化學試劑有限公司；DPPH：上海藍季科技發展有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：昆山譜森實驗室用品科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Alpha-1502紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司；SK8210HP型超聲波清洗器：上?？茖С晝x器有限公司；CP224C型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；SHZ-III A型循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟲草花粗多糖的制備

準確稱取1.0 g處理過的蟲草花干粉，放入250 mL錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，在超聲溫度45℃，超聲功率300 W的超聲波中提取30 min，提取完畢后，用循環水真空泵抽濾，取上層濾液用Sevag法[14]脫除蛋白后，提取溶液加入3倍體積分數為95%的乙醇，將沉淀在50℃條件下進行干燥處理，得到蟲草花粗多糖。

1.3.2 蟲草花多糖含量測定

蟲草花多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[15]。以葡萄糖標準溶液質量濃度（x）對吸光度值（y）進行線性回歸，得葡萄糖標準曲線回歸方程y=10.797x+0.0149，相關系數R2=0.9995。蟲草花多糖提取率計算公式如下：

式中：C為根據回歸方程計算出的多糖質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為蟲草花提取液定容的體積，mL；M為蟲草花干粉的質量，g。

1.3.3 蟲草花多糖提取工藝優化單因素試驗

以多糖提取率為評價指標，分別考察以下單因素的影響：①超聲波功率分別為200W、250W、300W、350W、400W的條件下進行提取，液料比30∶1（mL∶g），超聲時間30 min，超聲溫度40 ℃；②液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g）的條件下進行提取，超聲波功率300 W，超聲時間30 min，超聲溫度40℃；③超聲時間分別為10 min、20 min、30min、40min、50min的條件下進行提取，液料比30∶1（mL∶g），超聲波功率300W，超聲溫度40℃；④超聲溫度分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的條件下進行提取，超聲時間30min，超聲功率300 W，液料比30∶1（mL∶g）。

1.3.4 蟲草花多糖提取工藝優化正交試驗

根據單因素試驗篩選結果，采用L9（34）正交設計，以蟲草花多糖提取率為評價指標，考察超聲功率（A）、液料比（B）、超聲時間（C）和超聲溫度（D）4個因素對蟲草花多糖提取率的影響，正交試驗因素及水平見表1。

表1 蟲草花多糖提取工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

1.3.5 蟲草花多糖抗氧化性測定

將蟲草花粗多糖分別配制成質量濃度為0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL的溶液，研究其抗氧化性。

（1）蟲草花多糖對·OH的清除作用測定

·OH的清除能力測定參考陳曉寧等[16]的方法稍作修改。取2.0 mL蟲草花多糖溶液于25 mL比色管，依次加入FeSO4（6 mmol/L，2.0 mL），水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L，2.0 mL）和H2O2（7 mmol/L，2.0 mL），在35℃水浴中反應25 min后，在波長536 nm處測定吸光度值記為A1；同法測定A2和對照液A0的吸光度值。同時，以相同質量濃度的維生素C溶液作陽性對照，羥基自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為空白對照液的吸光度值（蒸餾水代替樣品）；A1為樣品的吸光度值；A2為對照組（蒸餾水代替H2O2）的吸光度值。

（2）蟲草花多糖對DPPH·的清除作用測定

DPPH·的清除能力測定參考ALONSO A M等[17]的方法稍作修改。分別取2.0 mL不同質量濃度（0.002 9 mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0116mg/mL、0.0147mg/mL）的蟲草花多糖溶液，加入DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L，2.0 mL），混勻，室溫條件下避光反應15 min后，并在波長517 nm處測定吸光度值。同時，以相同質量濃度的維生素C溶液作陽性對照，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為樣品被蒸餾水代替時測定的吸光度值；A1為測定樣品蟲草花多糖溶液的吸光度值；A2為采用乙醇替換DPPH-乙醇溶液時樣品的吸光度值。

（3）蟲草花多糖還原能力的測定

還原能力的測定參考魏明等[18]的方法稍作修改。在5支比色管中分別加入不同質量濃度（0.0029mg/mL、0.0058mg/mL、0.008 7 mg/mL、0.011 6 mg/mL、0.014 7 mg/mL）的蟲草花多糖溶液1.0 mL，依次加入磷酸緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L，2.0 mL），鐵氰化鉀溶液（1.0 g/mL，2.0 mL），混勻，在50℃的水浴中恒溫20 min后，冷卻至室溫后加入三氯乙酸溶液（0.1 g/mL，2.0 mL）搖勻。取2.0 mL反應液于比色管中，依次加入2.0 mL蒸餾水和三氯化鐵溶液（1.0 g/mL，0.4 mL），室溫下反應15min后，在波長700 nm處測定吸光度值（A700nm），以吸光度值（A700nm）的大小來衡量還原能力的強弱，吸光度值越大，還原能力越強。以蒸餾水代替樣品溶液為空白對照，以相同質量濃度的維生素C溶液作陽性對照，每組試驗平行進行3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖1可知，蟲草花多糖提取率隨著超聲波功率在200～400 W范圍內的增加先增大后降低。超聲功率為300 W時，蟲草花多糖提取率達到最大值為3.82%。這可能是超聲波功率大，所具有的能量較大，從而加速蟲草花中多糖的溶出；但當超聲波功率太大時，可能會破壞多糖的結構，導致提取率下降。因此，確定適宜的超聲功率為300 W。

圖1 超聲波功率對多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

2.1.2 液料比對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖2可知，隨著液料比在10∶1～50∶1（mL∶g）范圍內的增大，蟲草花多糖提取率呈先增大后減小的趨勢，當液料比達30∶1（mL∶g）時，多糖提取率達到最大為3.84%。這可能是溶劑用量的增大使細胞內外濃度差增大，從而提高多糖提取率；當液料比繼續增大時，多糖提取率減小，這可能是溶劑用量的增大，消耗更多的能量[19]。因此，確定適宜的液料比為30∶1（mL∶g）。

2.1.3超聲時間對蟲草花多糖提取效果的影響

圖2 料液比對多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the polysaccharides extraction effect of polysaccharides

由圖3可知，超聲時間在10～30min范圍內，蟲草花多糖的提取率隨超聲時間的延長而增大，當超聲時間為30 min時，提取率達到最大為3.81%；之后隨超聲時間的繼續增加，蟲草花多糖的提取率逐漸減小。這可能是因為在超聲波的過程中會產生大量的熱能，并且隨著時間增加，產生的熱能就越多，當熱能超過一定的限度時，就會破壞多糖的分子結構，使得提取率降低[20]。因此，確定適宜的超聲時間為30 min。

圖3 超聲時間對多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction effect of polysaccharides

2.1.4 超聲溫度對蟲草花多糖提取效果的影響

由圖4可知，隨著超聲波提取溫度的升高，蟲草花多糖提取率逐漸增大，當超聲波溫度達到40℃時，蟲草花多糖提取率達到最大為3.85%；之后繼續升高超聲波提取溫度，蟲草花多糖提取率呈現下降。這可能是隨著提取溫度的升高，多糖分子運動加快，同時可以增加溶劑的滲透能力，提取率隨之升高，但是過高的溫度可能會對多糖分子結構和生物活性產生破壞作用[21]。因此，確定適宜的超聲溫度為40℃。

圖4 超聲溫度對多糖提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction effect of polysaccharides

2.2 提取工藝正交試驗結果

由表2可知，影響蟲草花多糖提取率的主次順序依次為D＞B＞A＞C，即超聲溫度＞液料比＞超聲功率＞超聲時間。蟲草花多糖的最佳提取工藝參數為A2B2C2D3，由于正交試驗中沒有出現A2B2C2D3最佳組合，因此在該件下進行3次平行驗證試驗，測得蟲草花多糖平均提取率為3.88%，高于正交試驗中的組合，因此選擇最佳提取工藝參數為超聲功率為300 W，液料比為30∶1（mL∶g），超聲時間為30 min，超聲溫度為45℃。

表2 蟲草花多糖提取工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of Cordyceps militaris polysaccharides

2.3 蟲草花多糖抗氧化性分析

2.3.1 蟲草花多糖對·OH的清除能力

蟲草花多糖對·OH清除效果隨濃度變化見圖5。由圖5可知，蟲草花多糖在質量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內，隨著蟲草花多糖質量濃度的增加，清除·OH的能力增強。當多糖質量濃度為0.0147mg/mL時，對·OH的清除率可達到44.39%，與陽性對照液維生素C對·OH的清除率53.55%相比稍弱，但蟲草花多糖仍然表現出較強的清除·OH的能力。

圖5 不同質量濃度蟲草花多糖對·OH的清除效果Fig.5 Scavenging effect of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison·OH

2.3.2 蟲草花多糖對DPPH·的清除能力

蟲草花多糖對DPPH·清除效果隨質量濃度變化見圖6。由圖6可知，蟲草花多糖在質量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內，隨著蟲草花多糖質量濃度的增加，清除DPPH·的能力增強。當蟲草花多糖質量濃度為0.0147 mg/mL時，對DPPH·的清除率可達到56.34%，與陽性對照液維生素C對DPPH·的清除率72.47%相比較弱，但蟲草花多糖依然表現出一定的清除DPPH·的能力。

圖6 不同濃度蟲草花多糖對DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging ability of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militarison DPPH·

2.3.3 蟲草花多糖的還原能力

蟲草花多糖還原能力隨濃度變化見圖7。由圖7可知，蟲草花多糖在質量濃度0.002 9～0.014 7 mg/mL范圍內，蟲草花多糖還原能力隨質量濃度的增加而增強，但與陽性對照液維生素C的還原能力相比稍弱，但蟲草花多糖依然表現出有良好的還原能力，從而證明了其較好的抗氧化活性。

圖7 不同濃度蟲草花多糖的還原能力Fig.7 Reducing capacity of different concentration of polysaccharides in Cordyceps militaris

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗獲得了超聲波輔助提取蟲草花多糖的最佳工藝條件為：超聲功率為300W，液料比為30∶1（mL∶g），超聲時間為30min，超聲溫度為45℃。在此優化條件下，測得蟲草花多糖平均提取率為3.88%。

抗氧化性試驗結果表明，蟲草花多糖在質量濃度0.0029～0.014 7 mg/mL范圍內，·OH和DPPH·的清除能力與多糖質量濃度呈正相關性。當多糖質量濃度為0.0147 mg/mL時，對·OH和DPPH·的清除率可分別達到44.39%和56.34%，與陽性對照液維生素C對·OH（清除率53.55%）和DPPH·（清除率72.47%）的清除率相比稍弱，但蟲草花多糖仍然表現出較強的清除·OH和DPPH·的能力；蟲草花多糖的還原能力也隨質量濃度增大而增強，與同質量濃度陽性對照液維生素C的還原能力相比稍弱，但蟲草花多糖也同樣表現出良好的還原能力，說明蟲草花多糖具有較強的抗氧化活性。