耐熱木聚糖酶菌株的篩選鑒定及發酵條件分析

楊 然，張笑雨，劉朋肖，范光森，李秀婷*

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心（北京工商大學），北京 100048；2.北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048；3.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

作為一種高效、綠色、安全的半纖維素水解酶，木聚糖酶在食品焙烤及添加劑[1]、飼料工業[2]、助漂紡織[3]以及能源轉化方面[4]一直得到良好的開發與應用。如今，現代化工業生產環境對木聚糖酶特性的要求越來越嚴苛，從環境中篩選具有不同特性的木聚糖酶成為解決工業生產需求的途徑之一[5]。耐熱木聚糖酶作為一類可在高溫環境下對半纖維素進行特性降解的水解酶，其應用前景廣闊且市場需求強烈。目前，利用傳統篩選技術已獲得來源于細菌、真菌等耐熱木聚糖酶并對其發酵條件進行了研究。張曉元等[6]從土壤樣品中篩選獲得1 株芽孢桿菌，該菌可利用玉米芯發酵生產耐熱木聚糖酶，酶活力高達1 664.9 U/mL；吳小建等[7]從木薯廢棄物中分離得到1 株嗜熱真菌，經鑒定為嗜熱子囊菌，固體發酵產木聚糖酶效果較理想；而來源于疏綿狀嗜熱真菌的木聚糖酶分泌量較低，僅為68.5 U/mL[8]。隨著分子生物學技術的不斷更新，利用異源表達手段及分子改造技術已逐步獲得適宜工業生產需求的耐熱木聚糖酶。來源于GH11家族的中溫木聚糖酶XynZF-2，經理性設計后，在其結構中引入芳香族氨基酸殘基，突變酶最適溫度較原酶提高8 ℃且pH值穩定性更加寬泛[9]；吳芹等[10]對來源于米曲霉的木聚糖酶分子結構進行改造，在酶分子N端引入3 對鹽橋并在畢赤酵母中進行表達，突變酶的最適反應溫度提升至58 ℃且溫度穩定性得到了明顯的改善。可見，關于耐熱木聚糖酶的研究已成為木聚糖酶應用領域關注的新熱點，而尋求高產、新型、熱性能優良的木聚糖酶生產菌株是加快我國木聚糖酶深度工業化應用的基礎。

本研究旨在從酒曲中篩選獲得高產耐熱木聚糖酶菌株，并對其發酵產酶條件進行考察，以期進一步提高木聚糖酶活力，對其酶學特性進行探討，為木聚糖酶的擴大生產及工業應用提供新資源及基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品分別來自于山東淄博酒曲、山東淄博中酒曲庫、衡水老白干酒曲、福建紅曲、福建白藥酒曲、古大曲；櫸木木聚糖 美國Sigma公司；木糖及其他試劑均為國產分析純。

初篩培養基：胰蛋白胨0.3%，酵母浸粉0.2%，MgSO40.05%，K2HPO40.15%，KH2PO40.6%，瓊脂2%，200 目水不溶性自提玉米芯木聚糖1%，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖培養基：土豆200 g，煮沸20 min，4 層紗布過濾，加入葡萄糖20 g，補足水1 000 mL，固體培養基加2%瓊脂，自然pH值，115 ℃滅菌30 min。

發酵搖瓶培養基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.3%，硝酸鈉0.2%，KH2PO40.6%，K2HPO40.15%，MgSO40.05%，玉米芯（80 目）2%，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

TCYQ型臺式恒溫振蕩器 蘇州市培英實驗設備有限公司；雷磁pHS-3C型pH計 上海儀電科學股份有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋、BSC-130IIA2型潔凈工作臺 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Mini-PROTEAN Tetra System小型垂直電泳 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 自提玉米芯木聚糖的制備[11]

取經粉碎過80 目篩的玉米芯加入氫氧化鈉溶液中，固液比1∶10，煮沸后保持微沸2 h，4 層紗布過濾，棄濾渣，濾液冷卻后用濃鹽酸調pH 7.0，靜置過夜，10 000 r/min離心15 min得沉淀，用去離子水反復洗滌、離心，直至電導率小于100 μS/cm，將沉淀置于50 ℃條件下烘干并研磨，收集備用。

1.3.2 耐熱木聚糖酶產生菌的篩選

稱取不同來源樣品0.2 g于800 μL高純水中振蕩，依次稀釋至10-2、10-3濃度梯度，取200 μL上清液均勻涂布于初篩培養基平板上，分別標記，于50 ℃培養箱中培養3～4 d。從初篩培養基平板中挑選有透明圈的單菌落（菌株所產木聚糖酶可分解培養基中底物木聚糖，因此菌落周圍呈現透明圈現象），劃線分離。純化后的菌株轉接至發酵搖瓶培養基中（搖瓶容積250 mL，裝液量為50 mL），在50 ℃、200 r/min條件下恒溫發酵5 d，發酵液離心后取上清液在不同溫度（70、75、80 ℃）下測定木聚糖酶活力。

1.3.3 耐熱木聚糖酶產生菌的鑒定

將目標菌株接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中，觀察菌株形態及生長狀態，并進行顯微鏡結構觀察；真菌試劑盒提取菌株FSD0302總DNA，利用通用引物（NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’；NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’），擴增該菌的保守核苷酸序列，擴增程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；45～60 ℃、30 s；72 ℃、2 min；循環36 次；72 ℃延伸l0 min。獲得的保守序列與NCBI上檢索的同源序列進行比對，構建系統發育樹，最終確定該菌種屬。

1.3.4 單因素發酵條件優化

以發酵產酶培養基為基礎，逐步優化培養基中的玉米芯木聚糖粒度、玉米芯木聚糖質量濃度、培養基初始pH值、溫度和轉速等培養條件（搖瓶容積250 mL，裝液量為50 mL）。玉米芯木聚糖粒度：選擇粒度分別為8～20、20～40、40～60、60～80、80～120、120～200 目配制液體發酵培養基，添加量1%，于50 ℃、200 r/min培養5 d后測定發酵液木聚糖酶活力，確定最佳碳源粒度；玉米芯木聚糖質量濃度：選擇玉米芯木聚糖質量濃度分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g/100 mL配制液體發酵培養基，于50 ℃、200 r/min培養5 d后測定發酵液木聚糖酶活力，確定最佳碳源質量濃度；培養基初始pH值：在碳源粒度、碳源質量濃度確定的基礎上，分別將液體發酵培養基的初始pH值調至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，于50 ℃、200 r/min培養5 d后測定發酵液木聚糖酶活力，以確定培養基的最適初始pH值；溫度：在上述條件確定的基礎上，改變發酵發酵溫度，采用不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）對菌株進行發酵培養，200 r/min發酵5 d，測定發酵液木聚糖酶活力，確定最適發酵溫度；轉速：選擇150、175、200、225、250 r/min轉速于50 ℃培養5 d后測定發酵液木聚糖酶活力，確定最適培養轉速。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及酶譜分析

SDS-PAGE分離膠為12.5%（加入2%櫸木木聚糖），濃縮膠為4.5%，考馬斯亮蘭染色顯示蛋白帶，標準蛋白與樣品在同一條件下進行電泳。木聚糖酶樣品經電泳后，在25%的異丙醇溶液中復性，隨后用適宜緩沖液浸泡數次以洗去異丙醇，于30 ℃反應15 min，1%剛果紅染色20 min，1 mol/L NaCl溶液脫色至透明水解條帶出現。

1.3.6 木聚糖酶活力的測定

參照3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法。20 μL適當稀釋的酶溶液，加入到180 μL用0.05 mol/L、pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液配制的1%櫸木木聚糖底物溶液中，60 ℃反應10 min，用DNS法測定釋放的還原糖量，同時以木糖作標準。木聚糖酶活力單位（U）的定義為：在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmoL木糖所需要的酶量[12]。

1.3.7 蛋白含量的測定

參照Lowry等[13]的方法，以牛血清蛋白作為標準蛋白繪制標準曲線。

1.3.8 酶學性質分析

1.3.8.1 最適反應pH值及pH值穩定性

采用實驗室緩沖體系（pH 2.0～12.0）將粗酶液稀釋至合適濃度，參照1.3.6節方法測定木聚糖酶活力，確定最適反應pH值，定義最適反應pH值下測得的酶活力為100%；采用適當體積上述緩沖液體系與粗酶液混合，60 ℃保溫30 min后立即冰水冷卻，測定剩余木聚糖酶活力（未經處理的酶液為對照）。

1.3.8.2 最適反應溫度及溫度穩定性

粗酶液在50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃條件下按照1.3.6節方法測定酶活力，以確定最適反應溫度；將粗酶液與pH 5.5的底物分別置于不同溫度（55、60、65、70 ℃）下反應0.3、0.6、1、2、3、4 h，測定木聚糖酶活力，考察粗酶液的熱穩定性。

1.4 數據處理

圖像采用PowerPoint軟件處理；實驗數據采用Excel 2013軟件處理，發酵條件優化實驗每組數據設置3 次平行，結果取平均值并計算標準偏差；而關于酶學特性實驗設2 次重復，每組數據設置3 次平行，結果取平均值并計算標準偏差。

2 結果與分析

2.1 耐熱木聚糖酶產生菌的篩選

本實驗從眾多酒曲樣品中分離純化得到具有降解木聚糖能力的菌株40余株，進一步對其進行搖瓶發酵測定木聚糖酶活力，產酶量大于10 U/mL的菌株有10 株（表1），其中來源于山東淄博酒曲II編號為Z3-2的菌株所產木聚糖酶活力最高，達1 378.9 U/mL，且粗酶液最適溫度為75 ℃，初步選定該菌株為目標菌株，且按本實驗室菌株編號規則改寫標號為菌株FSD0302。

表1 木聚糖酶產生菌初篩Table 1 Primary screening of strains for producing xylanase

2.2 菌株FSD0302的鑒定

將菌株FSD0302接種于PDA培養基中，50 ℃培養2 d后肉眼可見白色絮狀絨毛菌落，隨著培養時間的延長，菌落增大且由綠灰色漸變至黑色。顯微鏡觀察結果如圖1所示，菌絲蓬松細長，具分隔；分生孢子垂直側生，孢子為球形單孢子，無孢子囊結構。

圖1 菌株FSD0302顯微鏡結構圖Fig. 1 Micrograph of strain FSD0302

為進一步確定該菌種類，結合分子生物學手段，提取菌株FSD0302核糖體18S rDNA保守序列進行聚合酶鏈式反應擴增。純化擴增產物后測序，在NCBI中進行序列同源性比對，并從GenBank數據庫中檢索挑選與目標序列同源性高的基因序列，采用鄰近相連法構建系統發育樹，結果如圖2所示，菌株FSD0302與疏綿狀絲孢菌（Thermomyces lanuginosus）ATCC 200065位于基因進化數中的同一分支且序列同源性達70%。最終結合菌落形態、顯微結構及分子生物學鑒定結果，確定菌株FSD0302為疏綿狀絲孢菌，并命名為T. lanuginosusFSD0302。

圖2 菌株FSD0302 18S rDNA基因序列系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining analysis of partial 18S rDNA gene sequence of strain FSD0302

2.3 T. lanuginosus FSD0302發酵產酶條件優化

2.3.1 碳源粒度對T. lanuginosusFSD0302產酶的影響

微生物來源木聚糖酶的產生需要木聚糖底物的誘導，因此在產酶條件優化時用自提玉米芯木聚糖替換玉米芯作為發酵碳源以期獲得高產量酶活力。實驗選取不同粒度的玉米芯木聚糖誘導T. lanuginosusFSD0302產酶，圖3結果表明，當玉米芯木聚糖粒度為20～40 目時，菌株所產酶活力最高為4 096.8 U/mL，且隨著碳源粒度的降低酶活力逐漸降低。分析原因可知，當碳源粒度過小時，微生物可快速分解碳源用于自身生長而導致搖瓶中溶氧量的不足，影響后期產酶[14]；另一方面，碳源顆粒過細會與其他營養物質形成的懸濁液黏度較大，影響菌株代謝產物的產生，使產酶水平降低[15]。玉米芯是我國主要的農業廢棄物之一，以玉米芯或玉米芯來源的木聚糖作為碳源進行生物質轉化，一方面可解決農業廢棄物廢置污染的問題，另一方面為生物質能源的轉化利用及農業附加值的創收都具有積極意義。

圖3 玉米芯木聚糖粒度對T. lanuginosus FSD0302產酶的影響Fig. 3 Effect of xylan particle size on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

2.3.2 碳源質量濃度對T. lanuginosusFSD0302產酶的影響

圖4 玉米芯木聚糖質量濃度對T. lanuginosus FSD0302產酶的影響Fig. 4 Effect of xylan concentration on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

如圖4所示，該菌產木聚糖酶活力隨碳源質量濃度的增加而升高，當碳源質量濃度增加至4.0 g/100 mL時，木聚糖酶活力最高。而當碳源質量濃度過高時，菌株產酶量反而降低，其原因可能是過多的碳源在發酵過程中形成了較厚的懸浮物，使發酵營養素混合不均，影響微生物對營養物質的利用，另外過高的碳源質量濃度降低了發酵環境中的溶氧量，不利于發酵產[16]。

2.3.3 培養基初始pH值對T. lanuginosusFSD0302產酶的影響

圖5 培養基初始pH值對T. lanuginosus FSD0302產酶的影響Fig. 5 Effect of initial medium pH on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

如圖5所示，隨著pH值的升高，T. lanuginosusFSD0302產酶活力逐漸上升，在pH 6.0時，木聚糖酶活力最高可達5 077.2 U/mL，之后隨著pH值的上升酶活力反而急劇下降。在微生物生長繁殖和代謝的過程中，由于營養物質的消耗及代謝產物的形成和積累，會導致培養基的pH值發生改變，因此發酵液初始pH值對菌株生長及產酶起著重要作用。疏綿狀絲孢菌CBS28854-M18發酵產木聚糖酶條件確定的最適pH值為7.0，高于本實驗結果，而發酵液終止pH值變化與本研究結果類似，均處于偏堿性（pH 8.1～8.9）范圍[17]。

2.3.4 溫度對T. lanuginosusFSD0302產酶的影響

溫度對嗜熱菌株發酵生長及代謝產物的產生和積累起著至關重要的作用，因此考察不同發酵溫度對T. lanuginosusFSD0302產木聚糖酶的影響。圖6表明，當發酵溫度為50 ℃時，木聚糖酶活力最高，這一結果與同類研究疏綿狀絲孢菌發酵產木聚糖酶的結果相同[17-18]。而當溫度低于或高于50 ℃時，菌株產酶能力明顯降低，即發酵溫度為45 ℃及55 ℃時菌株產酶活力分別為最高酶活力的83.2%和79.5%，較低的發酵溫度，延緩了菌體的生長及發酵周期，不利于酶蛋白的產生及積累；而較高的溫度，使微生物孢子快速萌發，菌體生長過快，加速菌絲體老化，酶產量降低。

圖6 發酵溫度對T. lanuginosus FSD0302產酶的影響Fig. 6 Effect of fermentation temperature on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

2.3.5 轉速對T. lanuginosusFSD0302產酶的影響

圖7 轉速對T. lanuginosus FSD0302產酶的影響Fig. 7 Effects of rotational speed on xylanase activity from T. lanuginosus FSD0302

轉速對發酵溶氧、熱傳遞、菌絲體狀態起著重要作用。隨著轉速的增加，T. lanuginosusFSD0302產木聚糖酶趨勢呈現先上升后下降的現象，在轉速為200 r/min時木聚糖酶活力最高（圖7）。滕超等[19]研究搖床轉速對嗜熱真菌FL12產木聚糖酶影響時發現，當轉速達到205 r/min時，菌株產酶能力最優，與本實驗結果相近，而當搖床轉速達到225 r/min以上時可導致真菌菌絲體破碎自溶，不利于木聚糖酶的產生及積累。因此，適宜的轉速是菌株發酵產酶的必要條件。

采用優化條件，即玉米芯木聚糖粒度20～40 目、質量濃度4 g/100 mL、培養基初始pH 6.0、發酵溫度50 ℃、搖床轉速200 r/min，對T. lanuginosusFSD0302產木聚糖酶歷程進行探究，結果如圖8A所示，從第2天起T. lanuginosusFSD0302產木聚糖酶水平呈直線上升趨勢，至第6天達到產酶高峰，即產酶量高達5 357.1 U/mL，蛋白質量濃度為0.51 mg/mL，而此時酶比活力達10 493.72 U/mg，是目前已報道疏綿狀絲孢菌液體發酵產木聚糖酶同類研究最高水平[20-22]。結合SDS-PAGE及酶譜（圖8B）分析可知，T. lanuginosusFSD0302產2 種木聚糖酶，分子質量約為20 kDa及60 kDa，且以低分子質量木聚糖酶為主。本研究結果與同類研究結果不同，大多數疏綿狀絲孢菌產單一組分木聚糖酶且分子質量較低（20～29 kDa）[17-18,23-24]，少數研究報道有高分子質量木聚糖酶產生[25]，而T. lanuginosusFSD0302可產兩種組分木聚糖酶，從分子質量初步判斷分屬GH10及GH11家族[26]。因此本研究篩選獲得的T. lanuginosusFSD0302具有可深入研究的價值。

圖8 T. lanuginosus FSD0302產酶曲線（A）及電泳酶譜圖（B）Fig. 8 Time course of xylanase production (A) and SDS-PAGE and zymogram (B) of xylanase from T. lanuginosus FSD0302

2.4 T. lanuginosus FSD0302所產木聚糖酶的酶學性質

2.4.1 粗酶液最適pH值及pH值穩定性

相關疏綿狀絲孢菌產木聚糖酶的研究指出，該類菌所產木聚糖酶的最適pH值在6.0～7.0居多[27-28]，而T. lanuginosusFSD0302所產木聚糖酶粗酶液在pH 5.5及pH 7.5時表現出較高的相對酶活力（圖9），此結果可能與該菌同時可產兩種類型木聚糖酶有關，這一發現對拓寬該類菌所產木聚糖酶的種類及耐熱木聚糖酶的應用有積極意義。

圖9 粗酶液最適pH值Fig. 9 Optimal pH of crude xylanase

T. lanuginosusFSD0302所產木聚糖酶粗酶液在pH 4.0～9.0范圍內表現出良好的穩定性，且在pH 5.0～8.0之間殘留酶活力高達80%以上（圖10）。目前報道的大多數疏綿狀絲孢菌所產木聚糖酶的pH值穩定范圍在5.0～9.0之間[29-31]，其中T. lanuginosusW205所產單一組分木聚糖酶的pH值穩定范圍為5.0～10.5，該酶可水解木聚糖生成以木二糖、木三糖為主的低分子質量木聚糖且無木糖產生[24]。

圖10 粗酶液pH值穩定性Fig. 10 pH stability of crude xylanase

2.4.2 粗酶液最適反應溫度及溫度穩定性

圖11 粗酶液最適溫度（A）及溫度穩定性（B）Fig. 11 Optimal temperature and thermal stability of crude xylanase

嗜熱真菌的最適反應溫度一般在65～70 ℃之間，不同菌株之間略有差異。T. lanuginosusFSD0302木聚糖酶粗酶液的最適反應溫度為75 ℃（圖11A），這一結果優于陳威威[23]及李文鵬[32]等的研究結果。該菌在55 ℃反應4 h后殘余酶活力達60%以上，65 ℃反應40 min后仍能保留50%殘余酶活力（圖11B），說明T. lanuginosusFSD0302木聚糖酶具有較好的耐熱性及熱穩定性。

3 結 論

耐熱木聚糖酶可在高溫環境下發揮水解效力且表現出良好的溫度穩定性而備受關注。從自然環境中篩選耐熱菌株是獲取耐熱木聚糖酶的有效途徑。目前，耐熱木聚糖酶產生菌以細菌和真菌居多，而真菌由于其可高效胞外分泌而成為新的研究焦點。本研究以富含微生物菌群的酒曲為研究樣品，篩選獲得可產木聚糖酶的耐熱菌40余株，經木聚糖酶活力及酶耐熱性考察，最終確定了1 株目標菌株FSD0302。結合微生學物形態分析及分子生物學鑒定結果，確定該菌為疏綿狀絲孢菌。目前關于該類菌產耐熱木聚糖酶的研究較多，但天然菌株液體發酵產酶水平不高，本研究通過產酶條件優化，T. lanuginosusFSD0302所產木聚糖酶活力可達5 357.1 U/mL，比活力為10 493.72 U/mg，為疏綿狀絲孢菌液體發酵產木聚糖酶的最高水平。一般而言，疏綿狀絲孢菌所分泌的木聚糖酶為單一組分，而本研究的菌株FSD0302可產兩種木聚糖酶分子，分子質量分別約為20 kDa和60 kDa，粗酶酶學性質考察結果表明該菌所產木聚糖酶的最適溫度為75 ℃，55 ℃反應4 h后殘余酶活力達60%以上，65 ℃反應40 min后仍能保留50%殘余酶活力，粗酶的最適pH值分別為5.5及7.5，且在3.5～9.0范圍內可保留50%以上酶活力。由此可知，T. lanuginosusFSD0302所產木聚糖酶具有良好的熱穩定性且pH值耐受范圍較寬泛，具有可深入研究的價值及一定的工業應用潛力。