冷鮮灘羊肉貯藏中菌體蛋白質與微生物群落演替的關聯性分析

趙曉策，胡倩倩，羅瑞明*，張赫宇

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

動物被宰后，活體的生長代謝也同時停止，但由于機體呼吸與血液循環中斷，肌細胞內的各種需氧性生化反應停止，代謝與活體產生差異。冷鮮肉在貯藏過程中，貯藏溫度一直控制在0～4 ℃，能抑制表面大部分的嗜溫菌與致病菌的生長，而對嗜冷細菌的影響并不明顯[1]，所以冷鮮肉依舊會被外源性微生物污染，導致肉品腐敗變質[2]，使得環境中的菌落總數、pH值、揮發性鹽基氮值隨貯藏時間的延長發生變化，蛋白質的種類和含量也發生變化[3]，而微生物生長繁殖因為蛋白質的不同開始相互競爭，最后能適應一切不利的生長環境，且對肉品變質發揮主要作用的微生物只有一小部分[4-6]。藍蔚青等[7]及劉朏[8]在研究冷卻肉時，均檢驗出其在貯藏過程中的優勢菌為假單胞菌屬、熱死環絲菌、氣單胞菌屬，然而若初始菌相中存在葡萄球菌，它會逐步躍升為優勢菌。其中假單胞菌成為肉品腐敗優勢菌的原因主要是：假單胞菌可以利用肉品在代謝過程中產生的葡萄糖，從而使假單胞菌的滋生能力優于其他競爭性菌群。Gill等[9]研究發現，假單胞菌的生長速率和數目與其他細菌相互作用關系不顯著。于見亮[10]發現假單胞菌的含量最高，幾乎達到了菌落總數的對數值；并隨著貯藏時間的延長，數目不停上升，一直是優勢菌。而宏基因組學[11]作為一種新的微生物研究方法，逐漸代替了變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、單鏈構象多態性、末端標記限制性片段長度多態性等技術，為全面認識其群落水平上的生態學意義和功能創造新的路徑。深入探究這些優勢菌的種類、生長狀態及代謝過程，在解決肉類腐敗變質問題時可做到對癥下藥[12-13]。

本實驗以貯藏過程中的冷鮮灘羊肉為研究對象，采用組合蛋白芯片與表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（surface enhanced laser desorption ionization time-of-f l ight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）平臺對冷鮮灘羊肉貯藏過程中的微生物蛋白質進行檢測，找出與其有關聯的19 個菌體蛋白質，并結合宏基因組測序的方法[3]分析細菌多樣性，找出貯藏時期的優勢菌。使用主成分分析（principal components analysis，PCA）及熱力圖分析研究微生物差異蛋白質與菌落演替的關聯性，找出優勢菌與微生物菌體蛋白質之間的關系，對冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物調控及其微生物群落演替驅動機制的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮灘羊后腿肉，購自于寧夏大夏牧場食品有限公司（灘羊飼養期間不做任何生物性防疫工作，且定期進行清糞、消毒處理），當天屠宰后立刻放入冷藏箱，運回實驗室后迅速放入-20 ℃冰箱1 h，使其中心溫度降至0 ℃，托盤密封包裝后將其取出置于0 ℃冰箱貯藏。

核糖核酸酶A、溶菌酶、S緩沖液、DV-A緩沖液、W2濃縮緩沖液、洗脫劑（均為分析純） 上海百賽生物技術有限公司；無水乙醇、甘油、異丙醇、異丁醇（均為分析純） 銀川泰豐生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Sorvall Legend Micro 17型常溫離心機 美國Thermo公司；vortex-genie2 G-560E型旋渦混合儀 美國SI公司；SPECTRAMAX PLUS384型酶標儀 美國MD公司；移液器 德國Eppendrop公司；JT-C型均質器漯河市金田試驗設備研究所；ZHWY-1102C型搖床中國智誠公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

無菌條件下，將灘羊后腿肉分割成大小相等的5 塊，保鮮膜密封包裝，放在0 ℃冰箱，采集貯藏0、4、8 d灘羊肉表面刮擦物150 mg，表面刮擦物含微生物、血液、肉汁液等[1]，每組樣本做5 個平行。

1.3.2 冷鮮灘羊肉微生物菌體差異蛋白質的獲取

胡倩倩等[14]采用組合蛋白芯片與SELDI-TOF-MS平臺對0、4、8 d的冷鮮灘羊肉表面微生物菌體蛋白質進行了分類總結，本研究采用同樣的方法分析菌體蛋白質在貯藏過程中的變化規律。

1.3.3 宏基因組測序法分析冷鮮灘羊肉微生物群落演替過程中的優勢菌

張赫宇[3]通過宏基因組技術對冷鮮灘羊肉中0、4、8 d微生物進行DNA提取→16S rDNA PCR擴增→Illumina MiSeq測序的統計分析，得到了灘羊肉中表面腐敗菌隨貯藏時間變化而顯示出的群落組成、豐度結構以及多樣性。本研究采用同樣的方法通過對菌群組成分析，剔除變異系數（標準偏差/平均值）大于15%的樣品[15]，研究灘羊肉貯藏過程中的優勢菌及其變化規律。

1.4 數據處理

采用Origin 2017對冷鮮貯藏期為0、4、8 d灘羊肉的優勢菌和菌體差異蛋白質的變化規律進行總結分析。利用R軟件的Pearson算法和SIMCA軟件（V14.1, MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden）對隨貯藏時間變化的菌體蛋白質峰面積平均值和表面主要腐敗優勢菌菌數量進行熱力圖分析和PCA，研究冷鮮灘羊肉表面微生物差異蛋白質與微生物群落變化的關聯性。

2 結果與分析

2.1 冷鮮灘羊肉宏基因組分析確定優勢菌及其變化規律

圖1 冷鮮灘羊肉貯藏中的細菌群落分布圖Fig. 1 Distribution of bacterial communities in fresh and chilled Tan sheep meat

從圖1可知，第0天時，假單胞菌（Pseudomonas）、不動桿菌（A c i n e t o b a c t e r）、微小桿菌（Exiguobacterium）、氣微菌（Aeromicrobium）、葡萄球菌（Staphylococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）等占大部分，其中假單胞菌為9.98%，不動桿菌為19.15%，微小桿菌為6.18%，氣微菌為9.84%，成為冷鮮灘羊肉貯藏第0天的優勢菌。這與周琰冰等[16]采用DGGE技術對0 ℃托盤包裝的冷鮮羊肉菌相分析，得出假單胞菌、芽孢桿菌和不動桿菌屬在冷鮮羊肉貯藏初期為優勢菌研究結果基本一致。與劉瑩瑩等[17]采用傳統方法對冷卻羊肉的初始菌相探究，得出致腐菌為假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌、葡萄球菌的研究結果一致。

冷鮮灘羊肉樣品貯存4 d時，假單胞菌、熱死環絲菌（Brochothrix）、埃希氏菌（Escherichia）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、梭菌（Clostridium）等占據優勢。其中假單胞菌迅速增長，從最初的9.98%增長到20.06%，并成為此時的優勢菌。熱死環絲菌為12.43%，埃希氏菌為10.62%，梭菌為7.31%、乳酸桿菌為6.01%，成為冷鮮灘羊肉貯藏第4天的優勢菌。第8天優勢菌的相對含量分別為假單胞菌33.70%、熱死環絲菌23.98%、埃希氏菌11.40%、乳酸桿菌7.54%。

假單胞菌到第8天時成為主要優勢菌，這是由于假單胞菌是一種需氧桿菌，冷藏條件下快速生長。托盤包裝下的假單胞菌首先將葡萄糖作為生長基質，當葡萄糖含量較低無法支撐其反應，則將氨基酸作為生長基質，產生氨等腐敗產物[18]。假單胞菌是貯藏第8天時的優勢菌，也是灘羊肉貯藏過程中主要腐敗菌。這與國內外對冷鮮羊肉中菌相變化研究一致。諸永志等[19]研究發現托盤包裝冷鮮羊肉中假單胞菌在貯藏第8天時比例為72.86%。熱死環絲菌雖然在貯藏初期占有的比例不大，但是迅速增長，到第8天時占總數的23.98%。由于熱死環絲菌是一種兼性厭氧微生物，托盤包裝冷藏下熱死環絲菌利用葡萄糖作為基質，將其分解為乙酸和已偶姻，同時還可以將亮氨酸和纈氨酸分解變成異戊酸和異丁酸。傅鵬等[20]對托盤包裝冷卻豬肉的探究中同樣得出，熱死環絲菌在初始菌相中所占的數量不多，但隨著貯藏時間的延長而快速增長的結果。

通過對冷鮮灘羊肉微生物多樣性的研究結果顯示，隨著放置時間的延長，微生物菌落總數呈明顯增長的趨勢，前8 d增長趨勢平穩，到第8天菌落總數對數值到達106CFU/g，之后菌落總數快速增大，超過106CFU/g[21-22]，說明此時的冷鮮灘羊肉腐敗變質，8 d后的冷鮮灘羊肉不存在微生物含量檢測意義。而在有效貯藏過程中的優勢菌有假單胞菌、熱死環絲菌、埃希氏菌和乳酸桿菌等。

2.2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體蛋白質的變化規律

圖2 冷鮮灘羊肉貯藏過程中菌體差異蛋白變化規律Fig. 2 Changes in differential bacterial proteins from fresh Tan sheep meat during chilled storage

如圖2所示，共12 個菌體蛋白質隨著貯藏時間的變化而明顯上升或下降，且變化幅度較大。其中壞死誘導疫霉蛋白質（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質類（M9074-86）、角蛋白質關聯蛋白質8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質C-II（M8136-55）隨著貯藏時間的延長，其所占比例有大幅度上升；與此同時，角蛋白質關聯蛋白質3-1（M10359-3）、GRF/GHRH 生長激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質（M7709-26）、載脂蛋白質E（M34203-3）隨貯藏時間的延長，其所占比例有在下降，表明在貯藏過程中這部分菌體蛋白質和微生物生長繁殖有關。

2.3 冷鮮灘羊肉菌體差異蛋白質與微生物群落演替的關聯性分析

將12 個菌體蛋白質與宏基因組測序得到的優勢菌假單胞菌、熱死環絲菌、埃希氏菌和乳酸桿菌進行關聯性分析。

2.3.1 PCA

利用SIMCA軟件對不同菌群及差異蛋白質數據進行對數轉換加中心化格式化處理，然后進行自動建模分析[23-25]。PCA模型的相關參數見“PCA模型參數”：選取SIMCA軟件建模的模型編號M01；SIMCA的模型類型PCA-X；模型的主成分2 個，分別表示差異蛋白質和菌群；模型的觀測個數23 個，包括篩選出的19 個差異蛋白質和4 個優勢菌；R2X(cum)為0.918，代表模型對X變量（差異蛋白質）的解釋性；R2Y(cum)為0.875，代表模型對Y變量（優勢菌）的解釋性[26-28]。

圖3 差異蛋白質-優勢菌的PCA得分散點圖Fig. 3 PCA score scatter plot for differential proteomics and dominant bacteria

從圖3可得，假單胞菌、熱死環絲菌與差異蛋白質壞死誘導疫霉蛋白質（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質類（M9074-86）聚類效果明顯，且呈正相關，與角蛋白質關聯蛋白質3-1（M10359-3）呈負相關；埃希氏菌、乳酸桿菌與角蛋白質關聯蛋白質8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質C-II（M8136-55）聚類效果明顯，且呈正相關，與GRF/GHRH 生長激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質（M7709-26）、載脂蛋白質E（M34203-3）呈負相關。說明這幾種蛋白質與相關微生物相互聯系、影響的程度較大。

2.3.2 熱力圖分析

為對PCA得分散點圖進行進一步驗證，利用R軟件的Pearson算法進行相關性計算[29]，得到的相關性系數（corr）矩陣分析結果和相關性P值矩陣分析結果繪制為熱力圖，以展示相關性分析結果（圖4）。

圖4 優勢菌-差異蛋白質相關性熱力圖Fig. 4 Correlation heat map between dominant bacteria and differential proteomics

由圖4可知，壞死誘導疫霉蛋白質（M8414-05）、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L（M10880-9）、生長抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質類（M9074-86）與假單胞菌、熱死環絲菌呈正相關，且相關性較大，說明這5 種蛋白質的存在有益于假單胞菌和熱死環絲菌的生存；角蛋白質關聯蛋白質3-1（M10359-3）與假單胞菌、熱死環絲菌呈負相關，且相關性較大，說明L40M6199-14抑制這兩種菌的生存。

角蛋白質關聯蛋白質8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質C-II（M8136-55）與埃希氏菌和乳酸桿菌呈正相關，且相關性較大，說明這3 種蛋白質有益于埃希氏菌和乳酸桿菌的生存；GRF/GHRH生長激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質（M7709-26）、載脂蛋白質E（M34203-3）與其呈負相關，相關性較大，說明這3 種蛋白質會抑制埃希氏菌和乳酸桿菌的生存；由上述可知，PCA及相關性熱力圖的結果相似，二者之間可以相互補充及驗證。

微生物一般利用體內酶將非蛋白氮類物質降解為氨，氨在酶的催化下同化為氨基酸，氨基酸經過體內的代謝最終合成自身生長需要的菌體蛋白質[30]。而微生物在生長繁殖過程中能夠產生一些抑菌和殺菌效果的活性物質，如溶菌酶、ε-聚賴氨酸、苯乳酸、乳酸菌肽[31]。根據上述結論可初步判定：假單胞菌屬和熱死環絲菌是冷鮮灘羊肉貯藏過程中主要優勢腐敗菌，且致腐能力強，與之呈正相關的壞死誘導疫霉蛋白質、NADH-泛醌氧化還原酶鏈4L、生長抑制素-28、ATP合酶F（0）復合體亞基C1、朊蛋白質類促進了假單胞菌和熱死環絲菌的增長，與之呈負相關的角蛋白質關聯蛋白質3-1抑制了假單胞菌和熱死環絲菌的增長；與埃希氏菌和乳酸桿菌呈正相關的角蛋白質關聯蛋白質8-1、抗菌肽及磷載脂蛋白質C-II促進了其增長，與之呈負相關GRF/GHRH生長激素釋放素、ATP合成蛋白質、載脂蛋白質E會逐漸被優勢菌降解，亦降低了它們的增長趨勢，抑制了埃希氏菌和乳酸桿菌的生長繁殖。

3 結 論

冷鮮灘羊肉微生物群落演替是從復雜到簡單的過程，即進行逆行演替。本研究采用宏基因組技術通過對菌群組成分析，對比了冷鮮灘羊肉貯藏過程中微生物的生長狀況，確定了寧夏鹽池地區冷鮮灘羊肉的優勢菌為假單胞菌、埃希氏菌、熱死環絲菌及乳酸桿菌；并指出其中的優勢菌群為假單胞菌，其次為熱死環絲菌。為探明微生物菌體蛋白質與菌落演替的關聯性，采用PCA及熱力圖分析，結果表明：在貯藏過程中，隨著假單胞菌和熱死環絲菌漸成為優勢菌，壞死誘導疫霉蛋白質（M8414-05）、N A D H-泛醌氧化還原酶鏈4 L（M 1 0 8 8 0-9）、生長抑制素-28（M3130-58）、ATP合酶F（0）復合體亞基C1（M7668-64）、朊蛋白質類（M9074-86）同時成為菌生長繁殖的主要蛋白質；角蛋白質關聯蛋白質3-1（M10359-3）卻逐漸被菌所降解。乳酸桿菌和埃希氏菌所占含量百分比的上升，導致角蛋白質關聯蛋白質8-1（M6658-62）、抗菌肽（M7451-79）及磷載脂蛋白質C-II（M8136-55）也成為菌生長繁殖的主要蛋白質；GRF/GHRH 生長激素釋放素（M5109-45）、ATP合成蛋白質（M7709-26）、載脂蛋白質E（M34203-3） 所占含量比例的下降，說明在菌的生長過程中這幾種蛋白質被緩慢降解，或被取代。