藏靈菇胞外多糖的理化性質及其在切達干酪中的應用

羅天淇，郭 婷，余志堅，陳 超，曹永強，楊貞耐,,*

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京 100048；2.東君乳業（禹城）有限公司，山東 德州 253000）

藏靈菇（又稱開菲爾粒）是由多種乳酸菌、酵母菌和醋酸菌穩定共生形成的特殊粒狀或片狀化合物[1]，能夠同時進行乳酸、乙酸、乙醇發酵[2]，是開菲爾傳統乳制品的發酵劑，同時也是潛在功能性乳品發酵劑來源[3]。研究表明，藏靈菇發酵乳中含有大量的乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），該類多糖對機體安全無毒副作用[4]且具有多種生理功能，如調節血脂血壓、提高免疫力[5]、減少氧化損傷[6]、抗腫瘤、改善調節腸道微生態環境[7]、抑制有害菌的黏附等。產EPS的乳酸菌應用到發酵食品中，可以改善食品的質構、口感、流變學特性和風味等指標，如防止乳清析出、提高黏稠度、凝乳強度等，同時賦予產品一定的營養保健功效[8-9]。除了可以對腸道微生物起到益生元的作用外，Russo等[10]發現將乳酸菌EPS加入培養基中，能夠對植物乳桿菌WCFS1和嗜酸乳桿菌NCFM的生長起促進作用。這些功能使得乳酸菌EPS在食品和非食品工業倍受青睞，正日益引起人們的廣泛關注。

近年來，研究表明菊粉、低聚半乳糖等糖類物質能夠在發酵乳制品中對發酵菌株起到促進作用[11-13]，而乳酸菌EPS受限于實際生產中轉化效率較低[8]，目前研究主要集中在EPS的生理活性以及高產乳酸菌EPS的篩選應用上，關于EPS直接應用于乳制品發酵的研究比較少見，尤其是EPS對發酵乳風味的貢獻還沒有明確結論。因此，本研究分離純化藏靈菇發酵產生的EPS，采用紅外光譜、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用、掃描電鏡、原子力顯微鏡等研究其結構特性，并將此EPS應用于切達干酪中，進一步研究其對發酵過程以及干酪品質的影響，以期為深入研究藏靈菇EPS在發酵乳制品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏靈菇 實驗室保藏；生牛乳（蛋白質3.09%，脂肪3.43%，乳糖3.91%） 北京市沙河春山奶牛場；脫脂乳粉 新西蘭恒天然乳業集團；商品發酵劑R-704、商品凝乳酶CHY-MAX 丹麥科漢森公司；單糖標準品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖） 美國Sigma公司；DEAE-Sepharose Fast Flow離子色譜柱 英國Waterman公司；Sepharose CL-6B凝膠柱美國Amersham Bioscience公司；透析袋（截流分子質量為8 000～14 000 Da） 北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；恒溫培養箱上海一恒儀器科技有限公司；數顯pH計 上海Mettler-Toledo儀器有限公司；SU8020場發射掃描電子顯微鏡、紫外-可見分光光度計、高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；TENSOR 27紅外光譜儀、原子力顯微鏡 德國布魯克儀器公司；7890A-7000 GC-MS聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

脫脂乳培養基 將質量分數10%的脫脂乳粉用蒸餾水還原制成脫脂乳培養基，115 ℃滅菌15 min。

SDM液體培養基（1 L）：胰蛋白胨10 g、YNB（酵母氮源）6.7 g、K2HPO42 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL，1 mol/L乙酸調pH值為6.6，121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 EPS的提取與產量測定

在實驗室保藏藏靈菇中，根據藏靈菇發酵乳凝乳時間、黏度及拉絲長度選取7 個較優樣品，使用脫脂乳培養基活化后，取5 g于100 mL無菌SDM液體培養基中37 ℃恒溫發酵18 h，然后100 ℃水浴加熱15 min以滅活可能降解多糖的酶類。EPS的提取參考Rimada等[14]的方法，向藏靈菇發酵液中加入80%的三氯乙酸溶液至終質量分數為4%，室溫下攪拌2 h后，10 000 r/min、4 ℃條件下離心45 min，去除細胞和蛋白。取上清液并加入兩倍體積的無水乙醇，4 ℃冷藏靜置12 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min。沉淀用蒸餾水溶解，裝入透析袋中透析24 h，每8 h換一次蒸餾水。之后使用苯酚-硫酸法測定EPS產量。

1.3.3 EPS的分離純化與鑒定

1.3.3.1 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子色譜柱純化EPS

使用超純水配制20 mg/mL的粗多糖凍干粉，依次用超純水（第1～30管）、0.2 mol/L NaCl緩沖液（第31～70管）、0.5 mol/L的 NaCl緩沖液（第71～100管）在陰離子交換柱上以1 mL/min的流速進行洗脫，洗脫液收集量為5 mL/管，檢測每管洗脫液的OD490nm，合并含有多糖的洗脫液，透析凍干，4 ℃保存。

1.3.3.2 Sepharose CL-6B凝膠柱層析純化EPS

將上一步得到的多糖組分使用0.9%的NaCl緩沖液配制成2 mg/mL的多糖溶液。使用0.9% NaCl溶液在Sepharose CL-6B凝膠柱上以1 mL/min的流速對多糖樣品再進一步純化，每管收集5 mL并檢測OD490nm，合并含有多糖的洗脫液，透析凍干，4 ℃保存。

1.3.3.3 紅外光譜分析

將2 mg純化的EPS凍干粉末和200 mg溴化鉀粉末混合均勻，并用壓片法壓成薄片狀，記錄并觀察4 000～400 cm-1范圍內EPS樣品的紅外光譜。

1.3.3.4 掃描電鏡觀察EPS分子形貌

將5 mg純化的EPS凍干粉樣品，均勻粘在云母片表面，噴金后使用掃描電鏡在2 000 倍和4 000 倍下觀察多糖分子形貌。

1.3.3.5 原子力顯微鏡觀察EPS分子形貌

使用超純水制備質量濃度為1 mg/mL的純化EPS，在氮氣保護下攪拌至充分溶解后，梯度稀釋成10 μg/mL的溶液并使用原子力顯微鏡進行觀察。

1.3.3.6 單糖組成

單糖組成的分析方法采用Wang Ji等[15]的方法。

1.3.4 EPS對發酵劑的作用研究

1.3.4.1 EPS對發酵劑生長的影響

在EPS添加量分別為0%、0.5%的MRS液體培養基中添加0.1 g/100 mL的商品發酵劑R-704，連續培養24 h并檢測OD630nm值[12]。

1.3.4.2 EPS含量對發酵乳pH值的影響

在生牛乳中分別添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%的EPS，65 ℃殺菌30 min，冷卻至室溫，加入質量分數0.1%的商品發酵劑R-704，37 ℃培養6 h后測定pH值。

1.3.5 干酪的理化及微生物指標測定

1.3.5.1 切達干酪的制作

切達干酪制作參考郝曉娜等[16]的方法。生牛乳65 ℃殺菌30 min，室溫冷卻至31 ℃后添加0.1%的商品發酵劑R-704，并在菊粉組、EPS組分別添加1%的菊粉和EPS。在37 ℃保溫發酵，pH值降至6.5后以0.002 5 g/L的比例添加凝乳酶CHY-MAX，32 ℃靜置40 min待乳凝固后用干酪刀切割成小塊，升溫至41 ℃順時針緩慢攪拌30 min，便于乳清析出，當pH值降至6.2時排乳清，并于40 ℃堆釀，當pH值為5.5時，絞碎凝塊，加入質量分數1.5%的食鹽，然后裝入干酪模具壓榨。真空包裝，并于4 ℃條件下成熟12 周。

1.3.5.2 干酪得率的測定

干酪得率作為判斷干酪制作方法、設置工藝參數是否合理，是否適合生產應用的重要指標，其計算公式如下：

式中：M0為干酪質量；M1為牛乳質量；M2為發酵劑質量；M3為鹽質量。

1.3.5.3 干酪含水量的測定

干酪含水量的測定：參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[17]。

1.3.5.4 干酪保水率的測定

各組取3 g干酪樣品，4 500 r/min離心15 min，去上清液，稱量并作記錄，計算公式如下：

式中：M0為空離心管質量；M1為離心管加樣品的質量；M2為樣品離心除去上清液后的離心管加樣品質量。

1.3.5.5 干酪微生物指標與pH值的測定

干酪成熟期間每2 周取樣一次，采用MRS平板涂布法檢測干酪樣品中乳酸菌的活菌數。準確稱取1 g干酪磨碎后加入9 mL無菌生理鹽水中攪拌至溶解，梯度稀釋至一定倍數，吸取100 μL稀釋液均勻涂布于MRS培養基，37 ℃靜置培養48 h后進行菌落計數。

準確稱取10 g磨碎的干酪加入12 mL的蒸餾水中，勻漿處理使其混合均勻后，4 500 r/min離心15 min后去除上層脂肪，取下層溶液測pH值。

1.3.5.6 干酪風味的測定

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）法提取揮發性風味物質：萃取前將SPME纖維置于GC-MS進樣口老化。取10 g干酪和1 μL內標物2-甲基-3-庚酮于30 mL萃取瓶中，內標物質量濃度為0.816 μg/μL，加蓋密封，在60 ℃恒溫水浴下平衡30 min后，將SPME萃取纖維通過瓶蓋插入樣品中的頂空部分，推出纖維，頂空吸附30 min后拔出；快速插入GC-MS進樣口解吸5 min，進行GC-MS聯用分析。

GC條件：采用DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱進行分析。升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升溫到200 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；載氣（He）流速1.2 mL/min，不分流進樣。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍m/z 40～250。

1.3.5.7 風味物質香氣活性值（odor activity value，OAV）的計算：

式中：Ci為化合物的含量/（μg/g）；OTi為該化合物在水中的嗅覺閾值/（mg/kg）。

2 結果與分析

2.1 藏靈菇EPS產量測定

綜合藏靈菇發酵乳的凝乳時間、黏度及拉絲長度，從30 種藏靈菇樣品中篩選出的7 個較優樣品的EPS產量如圖1所示，確定藏靈菇KW1具有最高的EPS產量，為624.82 mg/L，與其他組有顯著差異（P＜0.05）。在相似培養、檢測條件下，與其他類似研究報道的EPS產量相比[15,18-20]，也處于較高水平，同時Bouzar等[21]指出乳酸菌EPS的產量一般都比較低（50～425 mg/L），因此藏靈菇KW1具有良好的EPS生產前景。

圖1 藏靈菇EPS產量Fig. 1 Production of EPS from Tibet kefir

2.2 EPS的分離純化

圖2 EPS經陰離子交換色譜柱分離得到的洗脫曲線Fig. 2 Elution curve of the EPS separated by anion exchange chromatography

圖3 EPS經Sepharose CL-6B凝膠柱純化的洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of the EPS purified by Sepharose CL-6B gel permeation chromatography

如圖2所示，藏靈菇KW1發酵培養物經除蛋白處理、醇沉、透析和冷凍干燥后得到的粗多糖，在陰離子交換色譜層析中被0.2 mol/L NaCl鹽溶液洗脫下來，表明此EPS是酸性多糖或者帶有酸性基團[22]。通過Sepharose CL-6B凝膠色譜柱進一步純化，不同大小的分子被洗脫分開，產生單一洗脫峰（圖3），獲得純化EPS并用于后續理化分析。

2.3 EPS官能團的紅外光譜分析

圖4 藏靈菇KW1純化EPS的紅外光譜圖Fig. 4 IR spectrum of the purified EPS from Tibet kefir KW1

圖4 顯示了藏靈菇KW1 EPS的紅外光譜分析結果。在3 420 cm-1附近的峰主要是由羥基的伸縮振動引起的峰，可能是來源于樣品吸附的水分、樣品分子內的羥基或分子間氫鍵的拉伸峰[23]；在2 925 cm-1附近的峰主要是由甲基或亞甲基的C—H鍵的伸縮振動引起的峰；在1 645 cm-1附近的峰主要是由羰基的伸縮振動引起的峰，這個峰是多糖的特征吸收峰[24]；1 563 cm-1和1 384 cm-1處的峰是羧基中C＝O的對稱伸縮振動峰[25]；1 231 cm-1和1 076 cm-1處的峰是C—O鍵的伸縮振動峰，其來源可能為C—O—H，或是糖環中的C—O—C，也有可能為縮醛鍵[23]；874 cm-1說明可能存在α-糖苷鍵[26]。

2.4 EPS單糖組成分析

對藏靈菇KW1提取純化后的EPS進行水解和乙?；螅玫较鄳难苌?，并通過氣相色譜測得藏靈菇KW1產EPS的氣相色譜圖（圖5B），與標準單糖色譜圖（圖5A）對比后可知，藏靈菇KW1 EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，相對物質的量比為1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，與紅外光譜結果一致。其他EPS組成的研究發現，植物乳桿菌KF5所產EPS是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照物質的量比例1∶4.99∶6.90組成[23]；來自雙歧桿菌22-5的EPS主要含有木糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和巖藻糖[27]；副干酪乳桿菌34-1產生的EPS只含有半乳糖，清酒乳桿菌O-1產生的EPS則含有葡萄糖和鼠李糖[28]。劉翠平等[29]發現，干酪乳桿菌LC2W使用葡萄糖作為碳源得到的EPS由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖組成，而使用乳糖作為碳源得到的EPS則是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成。因此EPS的單糖組成受到菌株類型、培養條件等因素的影響，藏靈菇KW1在其他培養條件下可能能夠產生不同組成的EPS。

圖5 單糖標準品（A）和藏靈菇KW1純化EPS（B）的GC-MS聯用分析圖Fig. 5 GC-MS analysis of monosaccharide standards (A) and the puri fi ed EPS (B)

2.5 EPS掃描電鏡和原子力顯微鏡分析

藏靈菇KW1 EPS的掃描電鏡觀察如圖6所示，EPS顯示出相對穩定的三維微觀結構（圖6A），EPS表面粗糙呈顆粒狀，整體上呈致密的網狀結構，內部分布著許多大小形狀相似的球形結構和不規則片狀結構。進一步放大倍數可以看出（圖6B），EPS表面結構緊致光滑，這種較為穩定的結構，可以賦予EPS特殊的流變學性質，例如提升產品的黏度、改善質構和保水特性[30]。據報道，從藏靈菇中篩選分離出的L. kefiranofaciens ZW3所產的EPS也具有類似的分子形貌[31]。而另一株從藏靈菇中篩選分離的植物乳桿菌KF5，其所產的EPS呈不規則片狀[23]。

圖6 藏靈菇KW1純化EPS的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of the purified EPS

平面圖像（圖7A）顯示，EPS分布不均勻，在某些區域EPS結構緊密呈膜狀，這說明EPS發生了聚集，在多糖質量濃度大的區域，羥基數目多，分子間的氫鍵締合作用增強，多糖聚合較緊密，形成膜狀結構[32]。在立體圖像（圖7B）中，可以觀察到EPS表現出高低不平、分布不均的狀態，平面圖像中的膜狀區域呈現出緊密的簇狀結構，而在其他區域可以看到多糖分子形貌如尖錐狀結構，高度在2.4 nm左右。

圖7 藏靈菇KW1 EPS的原子力顯微圖像Fig. 7 Atomic force microscopy images of the purified EPS

2.6 EPS對發酵劑生長的影響

圖8 EPS對發酵劑菌株生長的影響Fig. 8 Effect of EPS on growth of the starter culture

如圖8所示，在兩組液體培養基中，發酵劑菌株在調整期都生長緩慢，曲線較接近，3～4 h之后均進入對數生長期，菌株生長速度加快，但實驗組菌株的生長情況明顯要優于對照組，并且進入穩定期后，實驗組發酵液OD值顯著高于對照組（P＜0.05），表明EPS可能起到益生元的作用，從而促進發酵劑菌株的生長，也有可能EPS被微生物利用，為其穩定期的生長補充培養基營養的不足。

從圖9可以看出，EPS的添加量對發酵劑產酸有著顯著影響。隨著EPS添加量的提高，發酵乳產酸呈現先升后降的趨勢；在添加量為1%時，pH值降至約4.5，產酸達到最大值，說明在EPS的低添加量范圍內，隨著添加量的增加，其對發酵劑菌株的生長具有逐步增強的促進作用；添加量高于1%時，EPS對菌株的促生長作用隨著其添加量的升高而逐漸減弱，甚至可能抑制菌株的生長。這點與菊粉類似，曹永強等[33]發現，菊粉對乳酸菌有促生長作用，但是濃度過高會抑制乳酸菌的生長。

圖9 EPS添加量對發酵乳pH值的影響Fig. 9 Effect of different amounts of EPS addition on pH of fermented milk

2.7 EPS對切達干酪品質的影響

2.7.1 EPS對干酪得率、保水率的影響

表1 干酪得率、保水率Table 1 Yield and water retention rate of cheese

如表1所示，空白組干酪的得率、保水率與實驗組干酪有顯著差異（P＜0.05），而菊粉組和EPS組得率、保水率無顯著差異（P＞0.05），均能有效提高干酪得率，增加干酪保水率，這可能與菊粉和EPS能夠一定程度上改善干酪內部三維結構穩定性有關[11]。

2.7.2 EPS對干酪理化指標和微生物指標的影響

圖10 干酪成熟期間含水量變化Fig. 10 Changes in moisture content during cheese ripening

如圖10所示，在干酪成熟的過程中，干酪含水量隨著成熟時間的延長而下降，下降速度逐漸減慢；添加有菊粉、EPS的實驗組干酪含水量顯著高于空白組（P＜0.05），與郝曉娜等[16]添加產EPS菌株制備切達干酪的結果相似，這可能與菊粉、EPS強化干酪結構結合更多的水有關。而成熟期間各組干酪的pH值（圖11）逐步降低，之后趨于穩定，菊粉的加入對干酪pH值的影響比較明顯，而空白組與EPS組干酪pH值無顯著差異（P＞0.05），說明EPS的加入不會使干酪品質發生明顯偏差。

圖11 干酪成熟期間pH值變化Fig. 11 Changes in pH during cheese ripening

圖12 顯示干酪成熟期間活菌數的變化。成熟過程前6 周干酪中的微生物含量在不斷增加，之后趨于穩定。菊粉組和EPS組的微生物含量與空白組比較有顯著差異（P＜0.05），說明EPS添加于干酪中能起到與菊粉一樣的益生元作用，但是EPS組的活菌數對數值高于菊粉組，而產酸量卻不如菊粉組，這可能是由于EPS和菊粉在結構組成上存在差異，直接影響其對微生物發酵增殖的作用[11]。

圖12 干酪成熟期間乳酸菌含量變化Fig. 12 Changes in number of lactic acid bacteria of during cheese ripening

2.7.3 EPS對切達干酪風味的影響

2.7.3.1 EPS干酪揮發性風味物質的GC-MS結果分析

風味是反映食品品質的一個重要因素，目前關于EPS對干酪風味影響的研究較少，郝曉娜等[16]考察了產EPS益生菌L. plantarum1-2對切達干酪揮發性風味形成的影響，發現益生菌的加入增加了乙苯、十二烷、己醇和丙酮4 種風味物質，且其他共有風味物質在含量上也存在差異；Wang Ji等[15]指出產EPS植物乳桿菌SKT109能夠通過增加乙酸乙酯，3-甲基-1-丁醇，3-羥基-2-丁酮和丁酮的含量來改善切達干酪風味特征。

如表2所示，采用SPME-GC-MS，從成熟12 周的EPS干酪中共鑒定出69 種揮發性風味物質，包括烴類14 種，醇類14 種，醛類4 種，酮類7 種，酸類8 種，酯類21 種，其他化合物1 種。其中含量最高的為酯類化合物，含量為5 042.44 μg/kg，其次為醇類、酮類、烴類、酸類、醛類以及其他化合物，但是風味物質含量高低并不能說明對風味的貢獻度大小[34]，二者不存在直接關聯，因此需結合OAV法進一步分析各物質對干酪風味的貢獻。

表2 EPS干酪揮發性組分的定性定量結果Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatiles in EPS-supplemented cheese

續表2

2.7.3.2 EPS干酪風味活性物質的OAV分析

表3 OAV確定EPS干酪中的風味活性物質Table 3 Qualitative and quantitative analysis of volatile flavor compounds in EPS-supplemented cheese

OAV大于1的香氣化合物被認為是食品的香氣特征貢獻組分，香氣化合物的OAV越大，說明其對整體香氣貢獻越大[35]。如表3所示，在檢測出的69 種揮發性風味物質中，有17 種化合物的OAV大于1，即對EPS干酪的風味有貢獻作用，是EPS干酪中的風味活性物質，包括6 種醇類物質，1 種醛類物質，3 種酮類物質，7 種醛類物質。其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的OAV大于200，說明它們對EPS干酪的風味有關鍵性貢獻作用[36]。

發酵乳制品中醇類物質的來源主要有乳糖代謝、甲基酮類的還原、氨基酸的降解以及亞油酸、亞麻酸的降解這4 種。本實驗檢測出的6 種OAV大于1的醇類物質中，3-甲基-1-丁醇具有特殊不愉快氣味、有辛辣而令人厭惡味[37]；3-甲硫基丙醇具有典型的硫化物氣息，稀釋到一定程度后具有洋蔥、甜的肉湯的氣味[38]；2-庚醇具有蘑菇香氣，2-壬醇和1-壬醇分別具有黃瓜和青草氣味；苯乙醇濃度最高，來自芳香族氨基酸的降解，具有玫瑰花香、紫羅蘭香、茉莉花香等多種氣味。

醛類是干酪中重要的揮發性風味物質之一，但本實驗中僅有十二醛這1 種物質對干酪風味有貢獻，這可能與醛類屬于化學性質比較活潑的不穩定中間體化合物，在一定條件下易被還原成相應的醇有關[2]。

3 種OAV大于1的酮類化合物中，2-壬酮具有青香、脂肪香，2-十一酮具有脂肪香以及奶油、乳酪的味道[39]。一般認為酮類物質隨著碳鏈的增長香氣更加濃郁[40]，其中甲基酮類化合物被認為是表面霉菌成熟干酪和藍紋干酪的特征風味物質[41]。

酯類化合物是非常重要的一種呈香物質，在干酪中一般給人以甜的果香味，同時干酪中酯類化合物的存在還可以緩解短鏈酸類化合物引起的尖刺感，使整體風味變得柔和，但是過多的酯類化合物容易使得奶酪風味偏水果味[42]。在本實驗中，酯類物質含量最高，同時對EPS干酪風味貢獻最大。其中丁酸乙酯具有蘋果香氣；乙酸苯乙酯具有蜜糖、花香、果香、柑橘香氣[43]；癸酸乙酯呈現出葡萄氣味；δ-癸內酯呈現出桃子、乳脂氣味[39]；乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯也都能賦予食品水果香氣。同時，王磊等[44]認為異戊醛、乙酸乙酯、辛酸乙酯是切達干酪的主體揮發性風味物質，與本實驗結論部分相同，說明EPS的加入可能改變了干酪的風味特征。

在本實驗中，烴類物質和酸類物質的含量都不低，但是其OAV均小于1，這可能主要與這些揮發性風味物質感覺閾值較高有關，同時由于實際香氣組分之間在整體香氣貢獻中具有協同或拮抗效應，通常香氣成分之間相互作用以加成為主，協同和掩蓋作用較少[45]，一些OAV小于1的物質可能通過與其他物質間的協同效應而使其香氣被人們感知，因此這些物質也有可能對EPS干酪的整體風味有貢獻。

3 結 論

本研究對藏靈菇發酵產EPS進行了分離純化，確定該EPS由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，物質的量比1∶3.02∶2.12∶1.59∶3.04，在紅外光譜下顯示出典型的多糖吸收峰模式。掃描電鏡結果表明，該EPS微觀結構中分布著許多表面比較光滑的球狀、片狀結構；原子力顯微觀察，EPS呈現一定的聚集現象，具有膜狀、簇狀結構。藏靈菇EPS對發酵劑菌株的生長有促進作用，這種作用隨著添加量的增加先增后減。同時還能夠提高切達干酪得率、含水量、保水性以及成熟期間的活菌數。SPME-GC-MS分析結合OAV法表明，在69 種揮發性物質中，有17 種風味物質對EPS干酪整體風味有貢獻，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯是關鍵性風味物質。本研究將為藏靈菇EPS在乳酸菌發酵及干酪加工中的應用提供重要的技術參考。