紅提和糯米復合發(fā)酵葡萄酒工藝優(yōu)化及香氣成分分析

葉林林，楊 娟，陳 通，李圓圓，吳峰華，劉興泉*，何志平*

（浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 杭州 311300）

紅提（Vitis vinifera ‘Red Globe'）是我國鮮食葡萄的主要品種之一，含有較豐富的維生素、礦物質、氨基酸等，味道甜美、口感優(yōu)良，是一種具有代表性的鮮食葡萄[1]。鮮食葡萄具有不耐貯運、易受機械損傷和雜菌污染等特點，嚴重影響商品價值，特別是我國南方地區(qū)，葡萄多在高溫多雨的夏季集中上市，除了貯運問題，還有銷售難題[2]。2016年我國鮮食葡萄產(chǎn)量為1 080萬 t，占我國葡萄總產(chǎn)量的78.6%[3]，而每年約有27%的鮮食葡萄采后腐爛[4]。因此，將鮮食葡萄釀成葡萄酒可以較好的解決這一問題，同時能提升鮮食葡萄經(jīng)濟價值。但鮮食葡萄含糖量相較于釀酒葡萄偏低，直接釀制的鮮食葡萄酒存在口感欠佳、口味偏淡等缺陷，依據(jù)鮮食葡萄自身特點，開發(fā)一種適合鮮食葡萄酒的釀造工藝具有較好的實際意義。

糖是酵母進行乙醇發(fā)酵的主要基質，適宜的糖度有利于乙醇發(fā)酵的進行[5]。葡萄中的含糖量常會受自然因素、地域因素、采收等影響而發(fā)生變化，當葡萄含糖量較低時，發(fā)酵前往往需要通過人工手段調整葡萄汁中的糖分來提升葡萄酒的乙醇體積分數(shù)及風味。過高的糖分會造成發(fā)酵環(huán)境滲透壓過高，引起酵母菌體積萎縮，細胞膜及菌體內的酶受到破壞，從而抑制酵母菌的生長和代謝[6]，而糖分過低會令釀成的葡萄酒口味淡薄，口感不佳[7]。紅提葡萄的糖度在16°Brix左右，專業(yè)釀酒葡萄的糖度通常可以達到22°Brix以上[8]。因此，控制適當?shù)某跏继嵌葘τ谄咸丫频陌l(fā)酵具有重要的意義。

糯米糖化液由糯米熟化后接種微生物糖化制得，富含多種氨基酸、糖類以及適量的有機酸、維生素和多種礦物質，是一種優(yōu)良的發(fā)酵基質[9]。本研究以紅提為原料，利用糯米糖化液作為紅提葡萄酒的發(fā)酵外源糖提高紅提葡萄酒品質。以響應面法優(yōu)化復合發(fā)酵紅提葡萄酒的發(fā)酵工藝，并采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術結合香氣活性值（odor activity value，OAV）法分析葡萄酒中關鍵香氣成分，為復合發(fā)酵紅提葡萄酒品質提升提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅提（品種為克倫生） 浙江省杭州市臨安區(qū)浙皖農(nóng)貿城；復興糯米 南陵縣復興米業(yè)有限公司。

甜味型甜酒曲（主成分為米根霉）、葡萄酒酵母BV818 安琪酵母股份有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級） 淄博長城化工有限公司；4-甲基-2-戊醇（≥99%） 美國Sigma公司；其他試劑為實驗室常用AR級試劑。

1.2 儀器與設備

QP-2010GC/MS GC-MS聯(lián)用儀（配RTX-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm））、UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；50/30/μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司；0～32°Brix手持折光儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合發(fā)酵紅提葡萄酒釀造工藝流程

紅提→破碎↓糯米→浸泡→蒸熟→接種→糖化→過濾→滅菌→糯米糖化液→添加SO2→接種酵母→恒溫發(fā)酵7 d→過濾→陳釀→成品酒。

具體步驟：糯米25 ℃浸泡8 h，至沸水鍋內蒸20 min，淋飯法冷卻后接入干糯米質量0.4%的安琪甜酒曲于發(fā)酵罐中30 ℃恒溫糖化3 d，待糖化完成后過8 層綿紗布，并在85 ℃滅菌30 min得糯米糖化液。新鮮紅提去壞果、去柄后漂洗，瀝干后破碎得紅提果漿。取紅提果漿與糖化液按一定比例混勻后分裝于發(fā)酵罐中，每個發(fā)酵瓶總體積為1 L。添加SO2（本研究中用焦亞硫酸鉀替代，SO2當量為50%，下同），靜置8 h后接入活化酵母于發(fā)酵罐中密封恒溫發(fā)酵7 d，用8 層紗布過濾，靜置48 h后取上清液陳釀。此工藝中紅提和糖化液的初始糖度分別為：16°Brix和45°Brix，體積比1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的初始糖度分別為30.5、25.7、21.8、20.1°Brix。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 發(fā)酵菌種的確定

取糖化液與紅提果漿按體積比1∶4混勻，添加80 mg/L的SO2，分別接種1 g/L的BV818、RW和SY酵母，在20 ℃溫度條件下發(fā)酵7 d，比較其乙醇體積分數(shù)和花色苷含量。

1.3.2.2 發(fā)酵溫度的確定

取糖化液與紅提果漿按體積比1∶4混勻，添加80 mg/L的SO2、1 g/L的葡萄酒酵母BV818，分別在15、20、25、30 ℃溫度條件下發(fā)酵7 d，比較其乙醇體積分數(shù)和花色苷含量。

1.3.2.3 體積比的確定

取糖化液和紅提果漿分別按體積比1∶1、1∶2、1∶4、1∶6混勻，加入80 mg/L的SO2、1 g/L的選定酵母，在20 ℃溫度條件下發(fā)酵7 d，比較其乙醇體積分數(shù)和花色苷含量。

1.3.2.4 酵母接種量的確定

取糖化液與紅提果漿按體積比1∶4混勻，添加80 mg/L的SO2，分別添加0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的選定酵母，在20 ℃溫度條件下發(fā)酵7 d，比較其乙醇體積分數(shù)和花色苷含量。

1.3.2.5 SO2添加量的確定

取糖化液與紅提果漿按體積比1∶4混勻，分別添加40、80、120、160 mg/L的SO2、1 g/L的選定酵母，在20 ℃溫度條件下發(fā)酵7 d，比較其乙醇體積分數(shù)和花色苷含量。

1.3.2.6 復合發(fā)酵紅提葡萄酒響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken響應面設計原理[10-11]，選擇SO2添加量、酵母接種量和發(fā)酵溫度3 個因素進行響應面試驗，以乙醇體積分數(shù)為響應值進行優(yōu)化，所有試驗均重復3 次。

1.3.3 乙醇體積分數(shù)和花色苷含量測定

乙醇體積分數(shù)測定方法參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、葡萄酒通用分析方法》[12]測定。

花色苷含量采用pH示差法[13]。分別用pH 1.0的緩沖液（0.2 mol/L KCl-HCl（25∶67，V/V））和pH 4.5的緩沖液（0.2 mol/L NaAc·3H2O-0.2 mol/L HAc（1∶1，V/V））將1 mL樣品液稀釋至10 mL，混勻，在520 nm波長處測定吸光度。以1 mL蒸餾水加9 mL相應緩沖液作為空白對照組，總花色苷含量（以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計）如下：

式中：A為吸光度；26 900為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；449.12為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質量/（g/mol）。

1.3.4 復合發(fā)酵紅提葡萄酒香氣成分分析

香氣萃取：采用頂空固相微萃取法[14-15]。取酒樣5 mL于20 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，加入10 μL由色譜級無水乙醇稀釋1 000 倍的4-甲基-2-戊醇為內標，放入磁力轉子，設置轉速800 r/min，45 ℃平衡10 min。插入經(jīng)老化的萃取頭（250 ℃老化30 min），45 ℃頂空萃取30 min，將萃取頭插入GC-MS進樣口，解吸5 min。

色譜條件：進樣口溫度250 ℃；升溫程序：40 ℃保持2 min，以8 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；載氣：高純He（99.999%）；載氣流速：1.00 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：電子電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描模式：Scan；掃描范圍：m/z35～500。

香氣成分分析：對GC-MS采集的數(shù)據(jù)結合譜庫NIST 08進行定性，以各香氣物質相對于內標物4-甲基-2-戊醇含量進行定量。主要香氣成分由OAV法確定，當香氣物質的OAV大于1時能對葡萄酒香氣產(chǎn)生貢獻，OAV越大，對葡萄酒香氣的貢獻就越大[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用Graphpad Prism 6和SPSS 22軟件進行數(shù)據(jù)處理，Design Expert 8軟件進行響應面優(yōu)化處理。所有實驗均重復3 次。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的確定

表1 酵母菌對復合發(fā)酵紅提葡萄酒的乙醇體積分數(shù)和花色苷質量濃度的影響Table 1 Effect of yeast type on concentration of alcohol and anthocyanins in wine

由表1可知，利用BV818酵母發(fā)酵的紅提葡萄酒具有較高的乙醇體積分數(shù)和花色苷含量，因此選定BV818酵母為發(fā)酵菌種進行下一步實驗。

2.2 復合發(fā)酵紅提葡萄酒單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵溫度對葡萄酒乙醇體積分數(shù)及花色苷含量的影響

由圖1可知，當發(fā)酵溫度為20 ℃時，葡萄酒的乙醇體積分數(shù)最高，為（12.4±0.2）%。在低溫下，酵母代謝活動受抑制，產(chǎn)酒能力下降；而溫度過高時，酵母代謝增強，衰老過快，成品酒的乙醇體積分數(shù)偏低、酒體粗糙、口感不佳[17]。當溫度升高時，葡萄酒中的花色苷含量隨著溫度升高呈下降趨勢，發(fā)酵溫度越高花色苷降解越多。綜合考慮，選擇發(fā)酵溫度20 ℃進行下一步實驗。

圖1 發(fā)酵溫度對紅提葡萄酒乙醇體積分數(shù)和花色苷質量濃度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on concentrations of alcohol and anthocyanins in wine

2.2.2 體積比對葡萄酒乙醇體積分數(shù)及花色苷的影響

圖2 體積比對紅提葡萄酒乙醇體積分數(shù)和花色苷質量濃度的影響Fig. 2 Effect of substrate ratio on concentrations of alcohol and anthocyanins in wine

由圖2可知，花色苷隨著體系中紅提比例的增加而增加，發(fā)酵體系中紅提占比越多花色苷含量越高，體積比為1∶1和1∶2的花色苷含量顯著低于體積比為1∶4和1∶6的（P＜0.05），因此，體系中糖化液比例過高不利于酒體外觀形成。乙醇體積分數(shù)隨著料液比中紅提比例的增加而減少，其比例大于1∶4時減少的趨勢變緩。在一定范圍內，糖化液占比越高，發(fā)酵體系的乙醇體積分數(shù)越高，過高濃度的糖分會引起發(fā)酵體系的滲透壓偏高，不利于酵母菌生長，導致發(fā)酵體系乙醇轉化率偏低[17]。按照每生產(chǎn)1 g乙醇需要消耗糖分1.7 g的理論值計算[18]，體積比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6分別對應的理論乙醇體積分數(shù)應為17.94%、15.18%、12.80%、11.84%。實際中，其乙醇體積分數(shù)分別達到理論值的93.10%、96.25%、98.57%、98.14%，可見在1∶1和1∶2的體積比時體系內乙醇轉化率偏低。體系內糖化液占比過高還會導致米酒味較重，不利于紅提葡萄酒的感官效果。此外，對于葡萄酒而言，在一定范圍內較高的乙醇體積分數(shù)有利于酒體后期的貯藏，綜合考慮，選擇體積比為1∶4進行下一步實驗。

2.2.3 酵母菌接種量對葡萄酒乙醇體積分數(shù)及花色苷的影響

圖3 酵母菌接種量對紅提葡萄酒乙醇體積分數(shù)和花色苷質量濃度的影響Fig. 3 Effect of yeast inoculum size on concentrations of alcohol and anthocyanins in wine

由圖3可知，隨著酵母接種量的增加，乙醇體積分數(shù)呈先上升后下降的趨勢，當接種量為1 g/L時乙醇體積分數(shù)最高，達到（12.6±0.1）%。接種量過低時發(fā)酵啟動時間推遲，同時也增大了發(fā)酵體系感染雜菌的機會。而接種量過大時，會消耗發(fā)酵體系中的養(yǎng)分用于自身增殖擴代，用于生產(chǎn)乙醇的底物就會相應減少，不利于葡萄酒的形成，并且接種量過多還會引起酒體的酵母味過重，導致葡萄酒品質降低[19]。酵母的接種量對葡萄酒花色苷含量的影響變化不顯著（P＜0.05）。綜合考慮，選擇酵母接種量為1 g/L進行下一步實驗。

2.2.4 SO2添加量對葡萄酒乙醇體積分數(shù)及花色苷質量濃度的影響

圖4 SO2添加量對乙醇體積分數(shù)和花色苷質量濃度的影響Fig. 4 Effect of yeast inoculum amount on concentrations of alcohol and anthocyanins in wine

葡萄酒生產(chǎn)過程中，需加入適量的SO2達到抑制有害微生物、抗氧化、護色、滅酶等作用[20]。由圖4可知，隨著SO2添加量的增加，葡萄酒的乙醇體積分數(shù)先增加后減少，當SO2添加量為80 mg/L時乙醇體積分數(shù)最高，達到（12.6±0.1）%。發(fā)酵體系中的SO2濃度過低則酒體易受雜菌污染，此時雜菌會與酵母菌進行發(fā)酵基質的競爭，不利于酵母菌產(chǎn)酒，而過高的SO2濃度在抑制雜菌的同時也令酵母菌活性大大降低，不利于酵母菌產(chǎn)酒。葡萄酒中花色苷的2號位碳容易受到HSO3-的親核攻擊，形成亞硫酸氫鹽加成物[21]，導致其花色苷含量下降，SO2添加量越多葡萄酒花色苷含量越少。綜合考慮，選擇SO2添加量為80 mg/L進行下一步實驗。

2.3 復合發(fā)酵葡萄酒發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗結果與分析

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗結果的基礎上，進行響應面分析試驗，試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for each term of the fi tted regression model

利用DXP 8.0軟件對表2據(jù)進行分析，建立如下回歸模型：Y=12.62+0.50A+0.41B+0.16C+0.12AB+0.075AC+0.20BC-0.94A2-0.81B2-1.11C2。將表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析（表3）。由表3可知，模型P＜0.000 1，說明該模型極顯著性，失擬項P＞0.05，不顯著，同時模型的決定系數(shù)R2=0.986 7，表明試驗結果與模型擬合度相對良好，可以使用該模型推測試驗結果。在因素作用中A發(fā)酵溫度、B酵母接種量以及二次項A2、B2、C2對乙醇體積分數(shù)的影響極顯著（P＜0.01）；SO2添加量對乙醇體積分數(shù)的影響顯著（P＜0.05）；交互作用AB、BC、AC對乙醇體積分數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。交互作用響應面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對復合發(fā)酵紅提葡萄酒乙醇體積分數(shù)影響的響應面圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of operating parameters on alcohol concentration of wine

2.3.2 回歸模型驗證實驗

經(jīng)回歸方程優(yōu)化后得到最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度21.46 ℃、酵母接種量1.15 g/L、SO2添加量84.39 mg/L，此條件下復合發(fā)酵葡萄酒的乙醇體積分數(shù)預測值可達12.76%。將此工藝條件進行適當調整，參數(shù)為發(fā)酵溫度21 ℃、酵母接種量1.2 g/L、SO2添加量84 mg/L，對該工藝進行3 次重復性驗證，測得復合發(fā)酵葡萄酒的乙醇體積分數(shù)為（12.7±0.1）%，與預測值相近，說明該模型能很好的預測復合發(fā)酵葡萄酒發(fā)酵條件與乙醇體積分數(shù)的關系。對優(yōu)化后的復合發(fā)酵紅提葡萄酒理化指標進行分析（表4）可知，該葡萄酒符合GB 15037—2006《葡萄酒》中關于乙醇體積分數(shù)不小于7%的標準；表觀顏色為桃紅色、酒體澄清透明；總糖含量達到干型酒標準，發(fā)酵完全，酸度適宜；酒體具有純正的果香及酒香、無酸敗，葡萄酒風格良好。

表4 復合發(fā)酵紅提葡萄酒理化指標Table 4 Physicochemical indexes of red globe wine

2.4 復合發(fā)酵葡萄酒香氣成分GC-MS分析

圖6 復合發(fā)酵紅提葡萄酒GC-MS總離子流圖Fig. 6 GC-MS chromatogram of red globe wine

表5 復合發(fā)酵紅提葡萄酒香氣成分鑒定結果Table 5 Aroma composition of red globe wine

復合發(fā)酵紅提葡萄酒香氣成分的總離子流圖見圖6，分析鑒定結果見表5。通過GC-MS分析復合發(fā)酵紅提葡萄酒香氣成分共鑒定出香氣物質39 種，包括醇類15 種、酯類15 種、酸類5 種、酮類1 種、烯萜類2 種以及苯酚類1 種。其中大于香氣閾值的有12 種，包括醇類4 種、酯類5 種、酸類2 種、烯萜類1 種。

OAV法是目前評價葡萄酒揮發(fā)性香氣成分較為客觀的方法[26]。醇類物質是葡萄酒中揮發(fā)性物質中含量最高的一類，其中的高級醇對酒體的復雜性具有重要作用。高級醇又稱為雜醇，是指含有3 個及以上碳原子的一元醇[27]，當其質量濃度不超過300 mg/L時，對酒體香氣復雜性具有積極作用[25]。本研究中紅提葡萄酒高級醇總量為128.44 mg/L，這對酒體香氣具有較積極的作用。本研究中OAV大于1的高級醇有正己醇、正庚醇、異戊醇、苯乙醇，這些醇為紅提酒帶來了玫瑰香、甜香、草木香等香味特征。

酯類是葡萄酒中的第二大揮發(fā)性成分，長期以來被認為是葡萄酒香氣的重要貢獻者，它們是葡萄酒中果香的主要來源之一[28]。復合發(fā)酵紅提葡萄酒中共檢測出酯類16 種，超過香氣閾值的有5 種，其中作為發(fā)酵酒主體香氣物質的4 種酯類（乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯與乙酸乙酯）中有3 種被檢出，分別是己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯[17]，三者的OAV分別達到了223.15、201.08、187.46，可認為是復合發(fā)酵紅提葡萄酒的酯香代表，為葡萄酒帶來了香蕉香、花香、菠蘿香、脂香等香氣特征。

葡萄酒中揮發(fā)酸含量過高會產(chǎn)生一些腐敗味、脂肪味等[29]。有研究發(fā)現(xiàn)C6～C10的脂肪酸對葡萄酒具有較大影響，當其質量濃度在4～10 mg/L時，酒體具有愉快的香氣，大于20 mg/L時則對酒體香氣不利[30]。復合發(fā)酵紅提葡萄酒中共檢測出5 種酸類物質，其中OAV大于1的有正己酸和正辛酸，其含量為1.32 mg/L和1.55 mg/L，對酒體的香氣具有一定的積極作用。

β-大馬士酮屬于C13-降異戊二烯類的化合物，其香氣閾值非常低，當其質量濃度達到0.14 μg/L就可達到人體嗅覺閾值，其對葡萄酒的香氣貢獻具有重大作用，是很多葡萄酒諸如霞多麗、西拉、品麗珠等的重要香氣物質[31]。本研究中復合發(fā)酵紅提葡萄酒中的β-大馬士酮的含量雖然僅為173.24 μg/L，但其OAV達到1 237.46，是該酒的主體香氣物質之一。β-大馬士酮的存在可以增強己酸乙酯果香并掩蓋葡萄酒的生青味[32]，同時給葡萄酒帶來甜香、異域花香、燉蘋果的香味，對酒體香氣特征起重要的貢獻作用。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和Box-Behnken響應面試驗優(yōu)化復合發(fā)酵紅提葡萄酒，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度21 ℃、酵母接種量1.2 g/L、SO2添加量84 mg/L、體積比1∶4，在此條件下發(fā)酵7 d得到了乙醇體積分數(shù)為12.7%的紅提葡萄酒。

采用HS-SPME萃取葡萄酒揮發(fā)性香氣成分，通過GC-MS結合OAV法分析復合發(fā)酵紅提葡萄酒的香氣成分共鑒定出39 種香氣物質。其中OAV較高的有12 種物質，主要為β-大馬士酮、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、癸酸乙酯，同時產(chǎn)品具有典型的葡萄酒酯香與果香。

本研究以糯米糖化液作為外源糖，進行紅提葡萄酒的復合發(fā)酵。該法可提高紅提葡萄酒的乙醇體積分數(shù)，同時保證葡萄酒的特征風味。為鮮食葡萄酒新工藝提供一定借鑒與參考。