高鹽稀態釀造醬油中香氣活性成分在滅菌前后的變化

康文麗，陳 亮，賀 博，吳 燦，周尚庭*

（加加食品集團股份有限公司，湖南 長沙 410600）

醬油是起源于我國的傳統調味品，如今其產銷量和生產企業規模均居調味品行業首位[1]。在醬油生產過程中，需要對醬油進行加熱滅菌處理，常用的方式有2 種，一種是采用巴氏殺菌，另一種是采用高溫瞬時殺菌。醬油的香氣是衡量質量的重要指標，而關于醬油滅菌前后香氣變化的研究報道較少。Steinhaus等[2]研究了日本醬油在145 ℃加熱20 min前后香氣的變化，發現經過加熱后會新生成糠硫醇、2-乙酰基-2-噻唑啉和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，同時2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和葫蘆巴內酯的含量降低，而苯乙醛含量增加；Kaneko等[3]研究了日本真空包裝醬油在80 ℃加熱30 min前后香氣變化，研究結果表明多數關鍵香氣成分含量經過加熱以后都略有升高，而4-乙烯基愈創木酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚含量增加最為顯著；Meng Qi等[4]研究了日本醬油中具有果香的5 種酯類關鍵香氣成分在80 ℃加熱30 min前后的變化情況，研究結果表明經過加熱后5 種酯類關鍵香氣物質含量均降低；以上研究均對醬油進行了較長時間的加熱處理。

分析醬油中香氣成分在殺菌前后的變化情況，首先需要對其中的揮發性成分進行提取，目前可用于提取醬油中的揮發性成分的方法主要有水蒸氣蒸餾[5]、同時蒸餾萃取[6]、溶劑直接萃取[7]、吹掃捕集[8]、固相微萃取[9]、溶劑萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發[10]。采用水蒸氣蒸餾和同時蒸餾萃取法時需要對樣品進行加熱，加熱過程中會生成新的成分；溶劑直接萃取所得提取物中常含有不揮發或難揮發性成分，直接分析會影響色譜柱的壽命；采用吹掃捕集進行提取時，影響吹掃效率的因素較多；固相微萃取只是選擇性吸附，萃取纖維的種類直接影響提取效果；溶劑萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發是目前國際上公認的提取揮發性成分比較好的方法，本實驗將采用溶劑萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發法提取高鹽稀態釀造醬油經過高溫瞬時殺菌前后的揮發性成分，利用分子感官科學的方法研究其中香氣活性物質的變化情況，為改進醬油生產工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

未滅菌的高鹽稀態釀造醬油樣品由加加食品集團股份有限公司生產，主要原料包括豆粕、小麥、鹽。

己醛（純度98%）、3-甲基-1-丁醇（純度99%）、2,5-二甲基吡嗪（純度99%）、乙酸（純度99%）、3-甲硫基丙醛（純度95%）、芳樟醇（純度98%）、丁酸（純度99%）、3-甲基丁酸（純度99%）、3-甲硫基丙醇（純度98%）、甲基環戊烯醇酮（純度99%）、愈創木酚（純度99%）、苯乙醇（純度99%）、麥芽酚（純度99%）、4-乙基愈創木酚（純度99%）、丁香酚（純度98%）、4-乙基苯酚（純度98%）、2-辛醇（純度99%）北京百靈威科技有限公司；4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮（純度98%）、2,6-二甲氧基苯酚（純度98%）、苯乙醛（純度95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（純度99%）、糠醇（純度＞98%） 北京華威銳科化工有限公司；5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（純度＞98%） 藤州瑞元香料有限公司；香蘭素（純度99%） 北大正元香料公司；C6～C30正構烷烴（色譜純） 美國Supelco公司；二氯甲烷、氯化鈉、無水硫酸鈉、碳酸鈉、鹽酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；苯乙酸（純度96%）由苯乙酰氯水解制得。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀、7890B GC儀美國安捷倫公司；Sniffer3000嗅覺（olfactometry，O）檢測器 德國Gerstel公司；蝶形玻璃儀器 莘縣京興玻璃器皿有限公司；TIC-6i型高真空泵組 英國Edwards公司；DKB-501A型超級恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將未滅菌的高鹽稀態釀造醬油在120 ℃加熱滅菌15 s，得到滅菌后高鹽稀態釀造醬油。

1.3.2 樣品香氣評價

參照GB/T 14454.2—2008《香料香氣評定法》，用評香條蘸取未滅菌和滅菌的高鹽稀態釀造醬油樣品，對其香氣進行評價[11]。

1.3.3 液液萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發法提取醬油中的揮發性成分

取100 mL醬油樣品和50 mL重蒸的二氯甲烷放入錐形瓶中，200 r/min室溫搖床1 h，結束后將醬油和二氯甲烷混合液4 ℃、8 000 r/min離心5 min，將下層有機層和上層醬油層進行分離。在分離出的醬油中繼續加入二氯甲烷，重復以上操作，共萃取3 次，合并有機相得到萃取液。用溶劑輔助風味成分蒸發法將萃取液中的揮發性成分與非揮發性成分進行分離；首先在蝶形玻璃儀器的一側加料漏斗中加入萃取液，其下接收瓶放入40 ℃水浴中，另一側加入液氮進行冷凝，其下接收瓶液氮冷卻，當真空泵壓力為2.5×10-5mbar時開始滴加萃取液，滴加完畢后繼續抽真空1 h，在液氮冷卻的接收瓶中得到揮發性組分。

為了便于分析，將得到的揮發性組分分為酸性組分和中堿性組分。取10.8 g無水碳酸鈉放入200 mL去離子水中攪拌溶解，每次取100 mL碳酸鈉溶液對由溶劑輔助風味成分蒸發得到的揮發性組分進行洗滌，分出有機相，然后再用飽和氯化鈉溶液洗滌（50 mL×2）有機相，得到的有機相即為中堿性組分，加入無水硫酸鈉置于-20 ℃冰箱中過夜；在水相中逐漸加入鹽酸溶液（由30 mL去離子水和30 mL鹽酸配制）調節溶液pH值至1～2，用二氯甲烷（50 mL×3）進行萃取，得到二氯甲烷萃取物，合并萃取物得到酸性組分，加入無水硫酸鈉置于-20 ℃冰箱中過夜。隨后，將酸性組分或中堿性組分用韋氏蒸餾柱進行蒸餾、氮吹濃縮至0.5 mL，采用GC-O和GC-MS聯用儀對所得濃縮物進行分析。

1.3.4 GC-O分析條件

G C條件：D B-W A X極性毛細管色譜柱（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；程序升溫：色譜柱起始溫度為40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持5 min；載氣He，載氣流量1.0 mL/min[12]；進樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，嗅聞口溫度220 ℃，經色譜柱分離后的組分以1∶2分別進入氫離子火焰檢測器和嗅覺檢測器；進樣量1 μL，采用不分流模式。

在實驗過程中由3 名經過訓練的嗅聞人員對樣品進行嗅聞，對嗅聞到的香氣區域、保留時間以及香氣強度進行記錄，每人每個樣品重復2～3 次，2 人以上嗅聞到的香氣給予記錄。

1.3.5 GC-MS分析條件

GC條件：與GC-O分析中的GC條件相同。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan；質量掃描范圍33～350 u。

1.3.6 定性與定量

定性分析：通過與標準品的香氣特征、質譜和保留指數進行比對的方法對揮發性組分進行定性。

定量分析：采用2-辛醇為內標，通過內標標準曲線的方法對香氣活性成分進行定量，其中以香氣活性物質的濃度與內標的濃度比為橫坐標（x），以二者的面積比為縱坐標（y）。

1.3.7 香氣活性值的計算

香氣活性值（odor activity value，OAV）等于香氣活性物質在醬油中的濃度與其自身在水中閾值的比值；OAV大于1的香氣活性物質對醬油的香氣輪廓貢獻大，被認為是醬油的關鍵香氣物質。

2 結果與分析

2.1 香氣評價結果

經過香氣評價發現滅菌前后的醬油樣品的整體香氣特征接近，滅菌前的醬油頭香中的煙熏香氣突出；但是滅菌后的醬油頭香中豆的青香和甜香，以及體香和基香中的醬香與焦甜均較未滅菌樣品的強，且香氣強度大，留香時間較長。

2.2 香氣活性物質的鑒定

經過GC-O分析，共嗅聞到24 種香氣活性區域，利用香氣特征、質譜和保留指數對嗅聞到的香氣進行初步定性，然后經過與標準品的相關數據和香氣特征進行比對定性，見表1。

表1 滅菌前后醬油中香氣活性成分Table 1 Odor-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

從表1可以看出，乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、麥芽酚、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、丁香酚、香蘭素、苯乙酸只在酸性組分中被嗅聞到，而2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪只在堿性組分中被嗅聞到。在鑒定出的24 種香氣活性物質中醇類5 種、酸類4 種、醛類4 種、酮類4 種、酚類5 種、吡嗪類2 種。

鑒定出的5 種醇類香氣活性物質中包括3-甲基-1-丁醇、芳樟醇、糠醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇，其中3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇作為香氣活性物質曾在中國醬油和日本醬油中被鑒定出[2,13-14]，它們可由醬油生產過程中所使用的酵母菌通過Ehrlich途徑代謝產生，其前體物質是亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸[15]；糠醇可由發酵過程中產生的葡萄糖經過氧化、脫羧和脫水形成[16]；意大利青霉菌可將酪蛋白氨基酸和葡萄糖轉變成芳樟醇[17]。鑒定出的4 種酸類香氣活性物質中包括乙酸、丁酸、3-甲基丁酸和苯乙酸，作為香氣活性物質它們都曾在醬油中被鑒定出[10,14]，其中乙酸和丁酸可以由醬油生產過程中所使用的乳酸菌代謝產生[18]，3-甲基丁酸被認為是酵母蛋白代謝的副產物[19]。鑒定出的4 種醛類香氣活性物質分別為己醛、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和香蘭素，己醛可由生產醬油時所使用的大豆或豆餅中的不飽和脂肪酸降解產生[20]；苯乙醛和3-甲硫基丙醛可由苯丙氨酸和蛋氨酸通過酵母的Ehrlich代謝途徑產生[15]，也可以通過Strecker降解產生[21]；香蘭素可由阿魏酸降解產生[22]，因為生產醬油時會使用小麥或小麥麩皮，而其中均含有阿魏酸。鑒定出的4 種酮類香氣活性物質分別為甲基環戊烯醇酮、麥芽酚、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮；其中4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮既可以由還原糖與氨基酸通過美拉德反應產生，也可由酵母代謝產生[2,10,23-24]；甲基環戊烯醇酮可由果糖降解產生[25]。鑒定出的5 種酚類香氣活性物質分別為愈創木酚、4-乙基愈創木酚、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚；作為香氣活性物質愈創木酚、4-乙基愈創木酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚都曾在日本醬油中鑒定出，被認為是酵母發酵產生或者是阿魏酸降解產生[10]。鑒定出的2 種吡嗪類香氣活性物質分別為2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，主要通過美拉德反應生成[26]。

2.3 香氣活性物質定量結果

由表2可知，香氣活性物質的總質量濃度在滅菌后略有降低（由57 629.37 μg/L降為51 229.57 μg/L）；醇類物質整體質量濃度呈降低趨勢（由7 622.66 μg/L降為4 921.17 μg/L），而糠醇質量濃度有所增加；在加熱過程中醇類物質可以被氧化成醛（3-甲硫基丙醛和苯乙醛質量濃度有所增加）或與酸反應生成酯，使其質量濃度降低；糠醇可由葡萄糖經氧化、脫羧和脫水形成[16]，加熱有利于其形成。酸類物質整體質量濃度也呈現降低趨勢（由31 059.27 μg/L降為23 818.51 μg/L），在加熱過程中酸類物質可與醇反應生成酯類物質（由于酯類物質一般閾值較高，在GC-O分析中沒有被嗅聞到）使其質量濃度降低。醛類物質的質量濃度都呈現升高的趨勢，因為其主要由自身的前體物質通過降解產生，溫度升高有利于降解反應，使其質量濃度升高。酮類物質質量濃度整體呈現升高的趨勢（由16 623.71 μg/L升為19 753.97 μg/L），但甲基環戊烯醇酮質量濃度有所降低；經過加熱滅菌處理以后4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮的質量濃度升高，與Steinhaus等[2]研究結果一致；麥芽酚可由還原性二糖降解產生[27]，加熱有利于其產生；甲基環戊烯醇酮（3-甲基-2-羥基-2-環戊烯-1-酮）的含量有所降低可能與其自身結構有關，它存在3 種互變異構體，溫度升高加速了異構體之間的互變，使其含量降低。酚類物質整體含量略有降低（由593.58 μg/L降為448.03 μg/L），而其中4-乙基苯酚的質量濃度有所升高（由49.92 μg/L升為59.32 μg/L）；Kaneko等[3]在研究日本醬油在加熱前后香氣的變化時所得結果也表明不同酚類物質含量變化不同。在滅菌前后吡嗪類物質的質量濃度基本沒有變化，這與其主要通過美拉德反應產生，滅菌加熱時間較短有關。

表2 滅菌前后醬油中香氣活性成分Table 2 Concentrations of aroma-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

2.4 鑒定出的香氣活性物質的OAV

表3 滅菌前后醬油中香氣活性成分OAVTable 3 OAVs of AACs identified in soy sauce before and after sterilization

如表3所示，在滅菌前后的樣品中均有18 種香氣活性物質OAV大于1，它們是醬油樣品的關鍵香氣成分，但是滅菌后樣品的總OAV增加；鑒定出的24 種香氣活性物質中有6 種（糠醇、乙酸、丁酸、苯乙酸、甲基環戊烯醇酮和2,5-二甲基吡嗪）在滅菌前后的樣品中OAV均小于1，它們對樣品的整體香氣貢獻較小；有5 種（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、3-甲基丁酸、3-甲基-1-丁醇、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚）物質OAV大于1，但滅菌前后無變化，對2 個樣品香氣差別基本沒有影響；有5 種（包括愈創木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創木酚和苯乙醇）物質在滅菌后的樣品中的OAV降低，其中愈創木酚和4-乙基愈創木酚具有煙熏香，OAV降低是滅菌后樣品煙熏香氣減弱的原因；有8 種（3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、苯乙醛、己醛、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、4-乙基苯酚和香蘭素）物質在滅菌后的樣品中OAV升高。3-甲硫基丙醛具有煮土豆香、醬香，是醬油的醬香特征香氣成分之一，OAV由2 869增加至3 797，使得滅菌后樣品的醬香、煮土豆香氣增強；麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（俗稱醬油酮）和4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（俗稱菠蘿酮），具有焦糖香，是醬油焦糖香特征香氣的主要成分，OAV增加，使滅菌后樣品的焦糖香增強；己醛具有青香和油脂香，它的OAV由25增加至35，使得滅菌后樣品的香氣透發；香蘭素具有香莢蘭和奶甜香，它的OAV增加是滅菌后樣品甜香增強的原因之一；OAV的結果與香氣評價的結果一致。結合OAV和定量結果可知3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈創木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創木酚、苯乙醛、己醛等在滅菌前后樣品中的質量濃度差別是導致醬油滅菌前后香氣差別的主要原因。

3 結 論

采用液液萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發法提取醬油滅菌前后樣品中的揮發性成分，提取物經過GC-O分析，共鑒定出24 種香氣活性物質，其中醇類5 種、酸類4 種、醛類4 種、酮類4 種、酚類5 種、吡嗪類2 種。

通過對鑒定出的24 種香氣活性物質進行定量分析和OAV計算，發現在滅菌前后的樣品中均有18 種香氣活性物質OAV大于1，是樣品的關鍵香氣物質；其中關鍵香氣物質中的3-甲硫基丙醛、麥芽酚、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈創木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈創木酚、苯乙醛、己醛等在滅菌前后樣品中的質量濃度差別是導致醬油滅菌前后香氣差別的主要原因。