超高效液相色譜-質譜聯用技術解析沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類天然產物結構

丁麗娜，邱亦亦，束 彤，阮 暉,3,4,*

（1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；2.青海省食品檢驗檢測院，青海 西寧 810008；3.浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310058；4.浙江大學寧波研究院，浙江 寧波 315100）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）別稱醋柳、酸刺、達日布，為胡頹子科沙棘屬的多年生落葉性灌木或喬木，是一種喜光、耐水、耐旱、生長性極好的小漿果植物，多為橘黃色或橘紅色[1-4]。我國是沙棘資源最豐富的國家，有“沙棘王國”之稱，沙棘藥食兩用方面的研究和應用在我國具有悠久歷史[5]。

沙棘果實中富含生物活性物質，如維生素、脂肪酸、黃酮類、酚類及有機酸、氨基酸和蛋白質、微量元素等。對其功效性天然產物的分離提取、結構解析和應用已開展較多研究，例如：沙棘油是沙棘果實中的最有價值的組分之一，對心腦血管、胃腸道、肝臟、皮膚組織等具有保護及修復作用[6]。并且，由于沙棘中含有大量氨基酸、有機酸、酚酸等多種營養物質，可以促進胃酸合成和分泌。因而其具有消食化滯、健脾養胃、疏肝利氣的作用。對于消化不良、腹脹痛、胃炎、胃潰瘍、腸炎、慢性便秘等均有極好作用。目前已有大量研究指出，沙棘及其提取物具有較強的抗脂質過氧化、清除自由基、對抗炎癥、抗病毒、抗過敏、抗疲勞等作用[7-10]。

沙棘果富含黃酮[11-14]，沙棘黃酮顯示出抗氧化、免疫調理、抗腫瘤等多重功效[15-17]。從沙棘葉中分離到蘆丁、槲皮素及其配糖體（3-O-葡萄糖苷）、山柰酚、異鼠李素等[18]。從沙棘籽中分離到蕓香糖苷槲皮素、蕓香糖苷異鼠李素、葡萄糖苷蕓香糖苷槲皮素、山柰酚、異鼠李素等[17]。采用高效液相色譜和超高效液相色譜-質譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技術，建立了基于7 種黃酮組分的沙棘葉質量控制方法[19]。超臨界CO2萃取技術在食品醫藥上應用較多，萃取劑CO2無毒、安全、廉價，其氣液臨界態溫度為31.7 ℃，可以在較低溫度下萃取，既節約能耗，又避免活性物質發生熱降解和發生副反應[20]。由于其低溫提取、無有毒殘溶和可以選擇性分離等優點，超臨界CO2萃取技術成為提取純化功效性天然產物的重要手段。之前的研究中，已采用超臨界CO2萃取技術高效獲取了沙棘果油[21-22]，但對其中所含黃酮類成分及結構尚未做過系統解析。本研究以青海產沙棘果為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術獲得沙棘果油，通過UPLC-MS技術和Peakview軟件擬合、二級質譜解析和紫外光譜及質譜數據比對，全面解析沙棘果中黃酮類成分及結構，為沙棘的高值化開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）產于青海省。

乙醇（一級色譜純） 天津市四友精細化學品有限公司；所有黃酮類標品（色譜純≥98%） 北京世紀奧科生物技術有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HGC-12A氮吹儀 天津恒奧科技發展有限公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SFE-2超臨界CO2萃取儀 美國Applied Separations公司；I-class UPLC儀 美國Waters公司；Triple TOF 5600+型飛行時間質譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Peakview色譜工作站） 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取適量沙棘干果，置于烘箱中以55 ℃烘干，再用粉碎機碎至粒狀，過40 目篩，得沙棘粉末。取適量沙棘粉，裝入50 mL提取釜中，設置提取條件：萃取壓力35 MPa，萃取溫度45 ℃，提取時間1 h，出口閥溫度110 ℃。待萃取完畢，再以無水乙醇為夾帶劑，流速0.8 mL/min，按照相同的萃取條件，更換新的萃取瓶來收集萃取液。待萃取完畢后，將萃取液溶解、濃縮、冷凍離心至合適濃度，過0.22 μm濾膜，待做UPLC-MS。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別稱取槲皮素、二氫槲皮素、山柰酚、橙皮素、異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并配制成每個組分約0.05 mg/mL的混合對照品溶液，搖勻，過0.22 μm濾膜，備用。參考對照品的質譜裂解特征，解析黃酮類化合物的質譜裂解規律。

1.3.3 液相色譜-質譜聯用方法

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX-SBC18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以0.1%甲酸-乙腈為流動相B，線性梯度洗脫，0 min 5% B，2 min 5% B，25 min 50% B，33 min 95% B；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm；進樣量5 μL。

質譜條件：UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液相色譜-質譜聯用儀，正負離子掃描模式；掃描范圍，m/z100～1 500；霧化氣（GS1）壓力55 psi；霧化氣（GS2）壓力55 psi；氣簾氣壓力35 psi；離子源溫度：600 ℃（正），-550 ℃（負）；離子源電壓5 500 V（正），-4 500 V（負）；一級掃描，去簇電壓100 V，聚焦電壓10 V；二級掃描，使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集質譜數據，CID能量為20、40 V和60 V，進樣前，用CDS泵做質量軸校正，使質量軸誤差小于2×10-6。

2 結果與分析

2.1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類化合物的結構鑒定

在已有文獻基礎之上，通過一級質譜給出化合物的準分子離子峰，得到化合物的相對分子質量，從而縮小鑒定化合物的范圍。然后經Peakview色譜工作站擬合，對比黃酮的紫外吸收峰，結合文獻，推測其可能的分子式和分子質量。進一步再做二級質譜解析，通過與標準品、已報道的紫外光譜及質譜數據的比對，確定黃酮化合物的分子結構或者其同分異構體。對于無相關標準品的黃酮化合物，則通過二級質譜解析推測其裂解途徑，確定其分子結構。

實驗共計發現18 種黃酮類化合物，按其結構類型可分為5 類，其中包括8 種黃酮醇苷元及黃酮醇苷，3 種二氫黃酮醇苷元及二氫黃酮醇苷，5 種黃酮苷元及黃酮苷，1 種二氫黃酮苷元和1 種黃烷醇苷。鑒定結果見表1。

表1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類化合物的鑒定結果Table 1 Main flavonoids identified in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

本研究采用的液相色譜-質譜條件使得超臨界CO2流體萃取出的沙棘果萃取液中主要活性成分得到有效分離。圖1為沙棘果超臨界CO2萃取物的液相色譜圖和質譜總離子圖。黃酮類化合物在負離子模式下干擾較少，也易被離子化，碎片信息更為準確，故本實驗采用負離子模式分析這些化合物。

圖1 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮的UPLC-紫外檢測（A）及總離子流圖（B）Fig. 1 UPLC-UV chromatogram and total ion current chromatogram of flavonoid compounds in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

采用質譜技術，根據二級質譜結果，解析化合物裂解途徑，確定沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮類成分的結構。

為方便討論黃酮苷元及糖苷質譜斷裂形成的碎片離子，本實驗對黃酮類化合物裂解后的特征碎片離子進行了系統命名。如圖2所示，其中，對黃酮苷元，i,jA和i,jB分別表示該黃酮苷元的碎片包含A-環和B-環，上標i和j顯示了C環上鍵的斷裂位置。對黃酮苷，k,lXj表示該碎片依然包括了黃酮苷元，j表示第j個糖基上鍵的斷裂（從黃酮苷元數起），k和l顯示了糖基環斷裂的位置。

圖2 本研究中裂解途徑所產生碎片的系統命名Fig. 2 Nomenclature adopted for various retrocyclization fragments observed in this study

2.1.1 化合物2、4、6、8、9、13、15、16的斷裂規律

化合物2、4、6、8、9、13、15、16皆為黃酮醇及其苷類，而其中化合物2經推斷為紫云英苷，即山柰酚-3-O-葡萄糖苷，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C21H20O11，相對分子質量為448。在負離子模式下，紫云英苷產生一級離子峰m/z447 [M-H]-，m/z447丟失一分子CH2O2后得到m/z401，丟失一分子CH2O4得到碎片m/z369，丟失一分子C3H6O3得到碎片m/z367。這其中，m/z357通過丟失一分子-C2H2-得到碎片m/z331，通過丟失一分子CH2O得到m/z 327，而m/z 327丟失一分子CO得到m/z 299，再丟失1 個—CH2—得到m/z 285，再通過連續丟失一分子CO和—OH分別得到碎片m/z 257和m/z 240。而一級離子峰m/z 447通過丟失C12H16O6后得到碎片m/z 191，再丟失一分子—CHO得到m/z 162，或者通過丟失一分子C2H2O2得到m/z 133，m/z 133丟失一分子H2O得到碎片m/z 115。二級質譜中的碎片離子峰皆可由紫云英苷通過相應的鍵斷裂而得，并且二級質譜得到的碎片離子峰和相關文獻報道[23-24]一致。因此，化合物2推測為紫云英苷。

化合物4經推測為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C22H22O12，相對分子質量為478。該物質二級碎片較集中且碎片離子豐度較大，在負離子模式下，產生一級離子碎片m/z 477 [M-H]-，m/z 477通過丟失一分子CO得到碎片m/z 433，通過丟失一分子葡萄糖—C6H10O5得到m/z 315，再丟失1 個H得到m/z 314，通過丟失一分子—CH3得到m/z 300，再連續丟失一分子—CHO和CO分別得m/z 271和m/z 243。而碎片m/z 315也可通過丟失一分子CH2O得到碎片m/z 285，再丟失一分子C6H4O4得到m/z 145。二級質譜中的碎片離子峰皆可由異鼠李素-3-O-葡萄糖苷通過相應的鍵斷裂而得，并且二級質譜得到的碎片離子峰和相關文獻報道[25]一致。因此，化合物4推測為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。

化合物6為山柰酚-3-O-鼠李糖苷，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C21H20O10，相對分子質量為432。取代基R5、R7以及R4′為羥基，而R3被O-鼠李吡喃糖苷取代。在負離子模式下，山柰酚-3-O-鼠李吡喃糖苷產生m/z 431 [M-H]-，m/z 431丟失一分子—C6H10O4即鼠李吡喃糖苷得到m/z 285，m/z 285再脫去1 個H得到m/z 284，在質譜圖中，m/z 285離子豐度要大于m/z 284，這說明前者離子比后者穩定。而m/z 285再丟失一分子CO得到m/z 257，碎片離子m/z 257丟失一分子CO2，得到m/z 213。如該化合物的裂解途徑所示，碎片m/z 213極不穩定，因此在二級質譜中的含量也極低。此外，山柰酚-3-O-鼠李吡喃糖苷還發生了RDA反應，產生典型離子峰m/z 151。

化合物8為黃酮醇衍生物，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C22H22O11，相對分子質量為462。取代基R5、R7和R4′為羥基，R3為O-鼠李糖苷，而R3′則被甲氧基取代。負離子條件下，產生分子離子峰為[M—H]-m/z 461，脫去鼠李糖基得到苷元離子m/z 315，接著脫去1 個H和2 個H分別得到m/z 314、313，在質譜圖中，m/z 315離子豐度遠大于m/z 314、313，證明m/z 315比后兩個都要穩定。m/z 315丟失一分子—CH3得到m/z 300，m/z 300再脫去1 個H得到m/z 299，m/z 299也可由m/z 314丟失一分子—CH3得到，因此m/z 299的離子豐度稍大于m/z 300。緊接著m/z 300、299分別失去一分子CO，產生m/z 272、m/z 271，m/z 271再脫去一分子CO得到m/z 243，除此之外，m/z 461發生RDA裂解得到1,3A m/z 151。

化合物9為槲皮素，其分子式為C15H10O7，相對分子質量為302，屬于黃酮醇類，其取代基R3、R5、R7、R3′、R4′為—OH，R6為H。產生典型離子有m/z 301 [M-H]-、273、245、229、179、151、149、121、107、93、83和65。m/z 301連續失去中性粒子CO產生m/z 273、m/z 245，m/z 245丟失1 個O產生m/z 229。除此之外，RDA裂解產生m/z 179（1,4B）、151（1,3A）和149（1,3B），m/z 151脫去1 個CO2得到m/z 107，m/z 149再連續脫去CO得到m/z 121、m/z 93。分子離子峰發生A環斷裂則得到m/z 83（R8、R10），再脫去1 個H2O得到m/z 65。

化合物13為山柰酚，分子式為C15H10O6，相對分子質量為286，其取代基R3、R5、R7、R4′為—OH，R6、R8為H。除了生成分子離子峰m/z 285外，丟失1 個H2O產生m/z 267，再丟失1 個CO生成m/z 239，此外，A環上發生斷裂，丟失C4H2O3重排生成離子碎片m/z 187。山柰酚二級碎片極少，但對照標準品的出峰時間以及二級碎片，基本可確定化合物13為山柰酚。

化合物15為異鼠李素，其分子式為C16H12O7，相對分子質量為316，其取代基R3、R5、R7、R4′為—OH，R6、R8為H，R3′則為甲氧基。因含有甲氧基，其分子離子峰m/z 315丟失甲基產生m/z 300，再丟失C4H4O2產生m/z 216，m/z 216丟失1 個—OH得到碎片離子m/z 199。m/z 300也可通過先丟失1 個—OH生成m/z 283，再連續丟失CO產生m/z 2 5 5和m/z 2 2 7。m/z 3 1 5也發生了C環常發生的斷裂（脫去C O2）從而產生碎片離子m/z 2 7 1，再丟失1 個C O生成m/z 243，又或者丟失C6H4O2生成m/z 163，再丟失1 個—CH3，生成m/z 148。除此之外，分子離子峰m/z 315發生RDA斷裂生成m/z 163（1,3B）和m/z 151（1,3A），碎片m/z 151丟失C3O2生成m/z 83。m/z 315的A環從C環上斷裂，生成m/z 107，再失去1 個CO2生成m/z 63。化合物11的二級質譜碎片離子相當豐富，并且通過與異鼠李素標準品對比，可知沙棘果中異鼠李素含量豐富。

化合物16為萬壽菊素，其分子式為C16H12O8，相對分子質量為332。其取代基R3、R5、R7、R3′、R4′為—OH，R6為甲氧基。因含有甲氧基，其分子離子峰m/z 331丟失甲基產生m/z 316，連續丟失CO生成m/z 303和m/z 275，而m/z 303和m/z 275再分別丟失1 個O生成m/z 287、m/z 259，m/z 259再丟失1 個O生成m/z 243。m/z 303也可通過失去C7H6O3生成m/z 165。分子離子峰m/z 331也可通過A環、B環以及C環的斷裂，產生相應的碎片離子。如A環從C環上斷裂，失去C9H4O5得到m/z 139，再失去1 個O生成m/z 123，最后失去—CH—并重排生成m/z 110。從C環上斷裂失去C9H6O4生成m/z 153。也可通過失去C7H7O2生成m/z 208。除此之外，m/z 331也可發RDA斷裂，生成m/z 180（1,3A）、m/z 151（1,3B）。

2.1.2 化合物3、5、7的斷裂規律

化合物3、5、7皆為二氫黃酮醇，化合物3為二氫槲皮素，即R3、R5、R7、R3′、R4′全為—OH，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C15H12O7，相對分子質量為304。其裂解規律具體如下：分子離子峰m/z 303失去1 個H2O生成m/z 285，再失去C9H4O5生成m/z 93；m/z 303失去1 個CO生成m/z 275；m/z 303失去1 個CO2生成m/z 259，m/z 259再失去1 個H2O生成m/z 241，也可通過失去C2H2O生成碎片離子m/z 217。而碎片m/z 217可通過丟失1 個H2O生成m/z 199，丟失1 個CO生成m/z 189，再丟失H4O2生成m/z 153，最后m/z 153丟失CO生成m/z 125，其中m/z 217還可通過再丟失1 個C2H2O生成m/z 175；m/z 303也可通過A環斷裂，丟失C11H8O5生成m/z 83；最后，分子離子峰m/z 303還可通過RDA斷裂生成m/z 151（1,3A）以及151（1,3B），m/z 151（1,3A）失去1 個CO2生成m/z 107，而151（1,3B）失去C5H2O2生成碎片m/z 57。

化合物5為3,5,7,3′-四羥基-4′-甲氧基黃酮，即二氫異鼠李素，其分子式為C16H14O7，相對分子質量為318。其裂解規律具體如下：分子離子峰m/z 317失去1 個H2O生成m/z 299；m/z 317失去1 個CO生成m/z 289，而m/z 289可以通過丟失C4H2O2生成m/z 207，再丟失1 個—CH3生成m/z 192，或是m/z 289丟失C9H8O3生成m/z 125，或是C環發生斷裂生成m/z 165（1,3B），而m/z 165通過分別丟失C4H5O、C6H4O2和CH4生成m/z 96、m/z 57和m/z 149；m/z 317還可通過A環、C環的斷裂生成相應的碎片離子，如丟失C7H5O3生成m/z 180，丟失C12H10O5生成m/z 83；m/z 317還可通過丟失1 個CO2生成m/z 273，而m/z 273可通過丟失C2HO生成m/z 232，丟失CO生成m/z 245，丟失—CH3生成m/z 258；m/z 317還能發生RDA斷裂，生成相應的碎片離子，比如RDA1,3斷裂生成m/z 151（1,3A）以及m/z 167（1,3B）這些很典型的二級碎片，而m/z 167（1,3B）丟失1 個甲基生成m/z 152。

化合物7為二氫山柰酚，即跟山柰酚相比較，連接C環上R2、R3的是C—C單鍵，而非雙鍵。其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C15H12O6，相對分子質量為287。二氫山柰酚的二級碎片較少，除了分子離子峰m/z 287外，還產生幾個比較典型的二級碎片離子，如經RDA斷裂生成m/z 135（1,3B）和m/z 151（1,3A），或是A環從C環上斷裂，丟失C9H8O4生成m/z 107。

2.1.3 化合物1、11、14、17、18的斷裂規律

化合物1、11、14、17、18皆為黃酮苷元及其苷類，其中化合物1為芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C26H28O14，相對分子質量為564，該物質在沙棘果中是首次報道。芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷在沙棘中含量較低，因此二級碎片豐度也較小。除了出現明顯的分子離子峰[M-H]-m/z 563外，二級裂解后通過丟失一分子C6H12O6得到碎片m/z 383，再丟失一分子CH2O得到m/z 353。除此之外，m/z 563通過丟失C13H14O6后得到m/z 297，再丟失一分子CH2O得到碎片m/z 267。m/z 563還可通過丟失一分子CH2O2得到碎片m/z 517，再連續丟失一分子CO2和CH2O分別得到碎片m/z 473和m/z 443。二級碎片皆可由芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷通過丟失相應的碎片得到，并且二級質譜得到的碎片離子峰和相關文獻報道[27]一致，所以推測基本正確。

化合物11為苜蓿素，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C17H14O7，相對分子質量為330，屬于黃酮苷元。在負離子模式下，產生分子離子峰[M-H]-m/z 329，因存在兩個—CH3，因此在二級質譜上產生明顯的兩個丟失—CH3的碎片，分別為m/z 314和m/z 299，再連續丟失CO得到碎片m/z 271、m/z 243、m/z 215，碎片m/z 243丟失1 個O得到m/z 227。除此之外，m/z 329通過丟失C6H6O3重排得到m/z 203。

化合物14為香葉木素，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C6H12O6，相對分子質量為300，屬于黃酮苷元。取代基R5、R7、R3′為羥基，R4′被甲氧基取代。香葉木素除了出現明顯的分子離子峰[M-H]-m/z 299外，進行二級質譜裂解后，丟失—CH3得到m/z 284，再脫去1 個CO得到m/z 256。二級質譜碎片離子較少，可能與香葉木素在萃取物中的濃度有關，但根據其裂解規律，可推斷該化合物為香葉木素。

化合物17推測為紫羅蘭素，為黃酮苷元，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C18H16O8，相對分子質量為360。在負離子模式下，產生一級分子離子峰[M-H]-m/z 359，二級裂解途徑有以下幾種：m/z 369通過丟失一分子C4H6O2生成m/z 273，再通過丟失一分子—CH3生成碎片m/z 258，再通過連續丟失CO生成m/z 230、m/z 202、m/z 174；m/z 369通過連續丟失一分子—CH3生成m/z 344、m/z 329，而m/z 329通過丟失一分子CO生成碎片m/z 301，或通過丟失一分子—OH生成碎片m/z 327，再連續丟失一分子H2O生成碎片m/z 309、m/z 291，m/z 291再丟失一分子CO2生成碎片m/z 247。

化合物18推測為刺槐黃素，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C16H12O5，相對分子質量為284。該物質在負離子模式下，主要以一級分子離子峰[M-H]-m/z 283直接裂解產生的二級碎片為主，如發生RDA斷裂，生成碎片離子m/z 151（1,3A），或丟失一分子—CH3生成m/z 268，丟失一分子CO2生成碎片m/z 239，一分子H2O生成m/z 265，再丟失一分子C2O3生成碎片m/z 193，或通過B環的斷裂，丟失C5H6O生成碎片m/z 183。二級碎片都能通過刺槐黃素斷裂相應的鍵得到，因此，化合物18可基本推斷為刺槐黃素。

2.1.4 化合物12的斷裂規律

化合物12為3,5,7-三甲基-4′-甲氧基黃酮，即橙皮素，為二氫黃酮苷元類，其分子式經Peakview色譜工作站模擬，為C16H14O6，相對分子質量為302。除了產生分子離子峰m/z 301外，質譜圖還產生了一系列二級碎片，如m/z 164、m/z 201就是由m/z 301分別丟失C7H5O3、C4H4O5而產生的。除此之外，m/z 301還能通過丟失1 個—CH3生成碎片離子m/z 286，再丟失C7H2O4生成m/z 136。m/z 301還能通過RDA斷裂生成m/z 177（1,4B），m/z 151（1,3A）以及m/z 149（1,3B），而m/z 149丟失1 個—CH3生成碎片m/z 134，m/z 151（1,3A）丟失1 個CO2生成m/z 107，再丟失2 個C生成m/z 83，最后失去1 個H2O生成m/z 65。

2.1.5 化合物10的斷裂規律

化合物10是此次定性分離中發現的唯一一個黃烷醇類黃酮，推測為兒茶素-7-葡萄糖苷，經Peakview色譜工作站模擬，分子式為C21H24O11，相對分子質量為452，除產生一級分子離子峰[M-H]-m/z 451外，通過C環的斷裂，丟失CH2O2生成碎片m/z 405，再通過丟失C6H4O2生成m/z 297，丟失C8H8O得到碎片m/z 177，最后丟失1 個O得到m/z 153；碎片m/z 405還可通過丟失葡萄糖苷C6H11O5得到碎片m/z 242，再丟失C8H6O2得到碎片m/z 108，再接著丟失一分子—CHO得到m/z 79。m/z 451也可發生RDA斷裂，生成碎片離子m/z 285（1,4A）。但由于該化合物相關文獻較少以及液相色譜-質譜聯用技術的局限性，無法確定該化合物所帶的六碳糖，所以只能通過分析相應的裂解途徑進行化合物的推測。

2.2 結構圖及相關裂解途徑

圖3 沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮化合物的化學結構式Fig. 3 Chemical structures of flavonoids in the supercritical CO2 extract of sea buckthorn berries

沙棘果超臨界CO2萃取物中黃酮化合物的化學結構式如圖3所示。以下是幾種典型化合物（化合物3：二氫槲皮素；化合物9：槲皮素；化合物10：兒茶素-7-吡喃葡萄糖苷）的裂解途徑解析如圖4～6所示。

圖4 化合物3二氫槲皮素的裂解途徑Fig. 4 Retrocyclization pathway of the chemical dihydroquercetin and its fragments

圖5 化合物9槲皮素的裂解途徑Fig. 5 Retrocyclization pathway of quercetin and its fragments

圖6 化合物10兒茶素-7-吡喃葡萄糖苷的裂解途徑Fig. 6 Retrocyclization pathway of catechin-7-pyran glucoside and its fragments

3 結論與討論

本研究采用超臨界CO2萃取技術獲得沙棘果油，通過UPLC-MS和Peakview色譜工作站擬合、二級質譜解析和紫外光譜及質譜數據比對，解析有關化合物的裂解途徑，鑒定出沙棘果油中含有18 種黃酮類化合物，包括8 種黃酮醇苷元及黃酮醇苷，3 種二氫黃酮醇苷元及二氫黃酮醇苷，5 種黃酮苷元及黃酮苷，1 種二氫黃酮苷元和1 種黃烷醇苷，其中芹菜素-6-C-葡萄糖苷-8-C-木糖苷、兒茶素-7-葡萄糖苷、苜蓿素、紫羅蘭素、刺槐黃素這5 種黃酮首次被發現存在于沙棘果中。

超臨界CO2萃取技術具有低溫提取、無有毒殘溶和可以選擇性分離的優點，并且特別適合分離提取微量及穩定性低的活性組分，這也是本研究能夠在沙棘果中發現5 種新黃酮化合物的重要原因。UPLC-MS是目前針對天然產物最常用的手段之一，可研究單體化合物的質譜裂解途徑，并在此基礎上進行結構解析。針對黃酮苷類的質譜裂解途徑的研究已經較為成熟，可快速鑒定黃酮化合物[27-30]。

本研究所確定的技術途徑原材料用量較少，分離簡便，所針對化合物覆蓋面廣、靈敏度高，特別是能夠分離到含量很低的黃酮類化合物，并且在沒有相關黃酮標品的情況下也能夠進行結構解析，從而系統地完成了沙棘果中黃酮類化合物組分譜分析和結構解析。但由于液相色譜-質譜聯用技術的局限性，無法精確地確定黃酮糖苷所連接的糖苷位置，也無法準確判斷五碳糖和六碳糖的同分異構體，如木糖和阿拉伯糖以及葡萄糖和半乳糖，還需借助相關文獻和其他鑒定技術更好地確定相應的化合物。但是，液相色譜-質譜聯用技術能夠快速且方便地進行黃酮苷元的分析鑒定，這也是其一大特色。本研究結果不僅可為沙棘果中的黃酮類天然產物的高值化開發提供理論依據，而且為其他生物資源中天然產物組分譜分析和相關結構解析提供了有效的技術平臺。