酶水解豌豆纖維粉制備低聚糖工藝優化

吳淑華，張喆浩，范玉艷，馬成業,2,*

（1.山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000；2.農產品功能化技術山東省高校重點實驗室，山東 淄博 255000）

豌豆纖維粉是工業生產豌豆淀粉或豌豆蛋白的主要副產物，膳食纖維占80%以上，主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，因多為不可溶性膳食纖維，若直接使用口感粗糙且易腐敗[1]。目前大多將其直接丟棄或粉碎后作為動物飼料使用，其附加值低，不能被良好的利用[2]。

近年來，對功能性低聚糖生理活性的研究及應用被廣泛關注。功能性低聚糖是由2～10 個相同或不同的單糖聚合而成，具有糖類某些共同的特性，可直接代替蔗糖作為食品配料，但不被人體胃酸以及胃酶降解，不在小腸吸收，可到達大腸，具有促進人體雙歧桿菌增殖、抗齲齒、預防便秘、促進鈣的吸收等生理功能[3]。而且低聚糖還具有良好的穩定性和保濕性，低甜度、低熱量，在食品開發中發揮著重要的作用[4]。低聚糖的提取一般采取水浸取、堿液提取、膜分離技術等，其中水浸取效率較低，堿液浸取雖然有效成分含量高，但時間太長；膜分離技術設備投資大，工藝較復雜。而采用酶解法，不僅效率高而且無污染、耗時少、操作簡單方便[5]。另外，纖維素酶能較有效地使豌豆纖維粉中的不溶性纖維素轉變成可溶性的葡聚糖，釋放包裹的非纖維成分，對細胞壁有一定的降解作用，這種部分降解作用使纖維結構變得膨松、溶脹，水和油更易于進入纖絲間隙，而且更多的基團得到暴露，并生成一些分子質量適中的具有持水和持油能力的降解產物，將羧甲基纖維素降解成低聚糖和單糖[6]。而木聚糖酶將更多的半纖維素降解，包括把不溶性半纖維素降解成可溶性半纖維素，同時使得豌豆纖維粉細胞壁的溶脹性、親水和親油能力得到相應改善。

本實驗以豌豆纖維粉為原料，研究酶解參數（料液比、木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量、反應溫度）對低聚糖得率、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力和清除羥自由基能力的影響，優化酶解參數，并對低聚糖的理化性質進行探究，以期為低聚糖的開發和應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆纖維粉（質量分數：水分8.02%，木質素22.58%，纖維素25.43%，半纖維素20.14%，不溶性膳食纖維84.10%，淀粉3.07%，蛋白質3.95%，脂肪0.21%） 山東健源生物工程股份有限公司；糖化酶（活力105U/mL） 上海源葉生物科技有限公司；耐高溫α-淀粉酶（活力4×104U/mL）、堿性蛋白酶（活力200 U/mL）、木聚糖酶（活力5×104U/mL）、纖維素酶（活力5×104U/mL） 江蘇銳陽生物科技有限公司；乙腈、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖，均為色譜純；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器公司；101-3AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；WFZ UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計上海尤尼柯儀器有限公司；FD-1D-50冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；TGL-16C高速離心機 上海安亭科學儀器廠；Q100差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；QUANTA250場發射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；1260 Infinity II液相色譜系統 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆纖維粉不可溶膳食纖維和低聚糖提取工藝

豌豆纖維粉40 g→水800 mL調漿→5% NaOH溶液調整pH值至6.2左右→添加液化酶（耐高溫α-淀粉酶）→液化（95 ℃，30 min；碘液檢測不變藍反應停止）→液化終點→冷卻到60 ℃→5% HCl溶液調整pH值至4.4左右→添加糖化酶（60 ℃，糖化3 h）→滅酶（100 ℃，10 min）→5% NaOH溶液調整pH值至7.8左右→堿性蛋白酶（55 ℃，酶解3 h）→滅酶（100 ℃，10 min）→抽濾→脫水→烘干（不可溶膳食纖維）→酶解（木聚糖酶、纖維素酶）→濃縮→干燥→粉碎→低聚糖

1.3.2 正交旋轉組合試驗

根據單因素試驗結果，以料液比、木聚糖酶添加量、纖維素酶添加量、反應溫度作為試驗因素。采用4因素5水平二次正交旋轉組合試驗設計安排試驗，對工藝進行優化，獲得最佳酶解工藝參數。4因素5水平二次正交旋轉組合試驗因素水平編碼見表1。

表1 二次正交旋轉組合試驗的因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for quadratic orthogonal rotatable composite design

1.3.3 酶解液中低聚糖得率測定

由木聚糖酶和纖維素酶酶解不可溶膳食纖維所得的酶解液，采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[7]測定其低聚糖得率。

1.3.4 酶解液抗氧化性測定

由木聚糖酶和纖維素酶酶解不可溶膳食纖維所得的酶解液，采用Zhang Xiaogang等[8]的分光光度計法測定其DPPH自由基的清除能力；采用Jiang Min等[9]的分光光度計法測定其羥自由基的清除能力。

1.3.5 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維、低聚糖吸附脂肪能力的測定

采用濾紙吸干游離的大豆油法測定吸附不飽和脂肪能力[10]；采用濾紙吸干游離的豬油法測定吸附飽和脂肪能力[11]。

1.3.6 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維物理化學性能測定采用靜置、離心法測定持水性[12]及膨脹性[13]。

1.3.7 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維、低聚糖掃描電子顯微鏡分析

采用掃描電子顯微鏡進行樣品的顆粒形貌觀察，取少許樣品均勻粘在導電膠上，然后噴金處理，噴金70?s，放入電子顯微鏡室觀察。在操作電壓10 kV下觀察淀粉的形態，并拍攝具有代表性的顆粒形貌[14]。

1.3.8 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維、低聚糖熱力學性質測定

準確稱取2～5 mg樣品，加入去離子水10 mg，密封于普通鋁盤中在20 ℃平衡16 h，之后放入差示掃描量熱儀中進行掃描，用鋁制空坩堝樣品池作參比物，升溫區間為20～100 ℃，升溫速率為5 ℃/min，載氣為氮氣，流速為50?mL/min[15]。描繪各樣品的吸熱曲線，測定樣品峰，起始溫度為To，峰值溫度為Tp，峰結束溫度為Tc和相變焓為ΔH。

1.3.9 高效液相色譜法測定酶解液中低聚糖的組分

取豌豆纖維粉酶解液加入等體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心去沉淀，去乙醇后再經陰陽離子交換樹脂脫鹽、脫色處理，利用旋轉蒸發器濃縮至可溶性固形物含量為1%，置于4 ℃冰箱備用。

色譜條件：Xbridge色譜柱，Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；示差折光檢測器；柱溫：41 ℃；流動相：乙腈-水（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 水解時間的確定

料液比1∶30（g/mL）、反應溫度50 ℃、木聚糖酶添加量150 U/g、纖維素酶添加量200 U/g、反應體系pH 5，水解時間與低聚糖得率的關系見圖1。由圖1可知，低聚糖得率隨水解時間的延長而增大，水解時間達到24 h左右時變化趨于緩慢，水解時間達到36 h時，低聚糖得率最高，水解時間繼續增加低聚糖得率有所下降，所以選擇水解時間為36 h。原因是開始時短時間內酶發生作用是逐漸增強的，但隨著反應時間的繼續延長，底物濃度隨之增大，酶解體系變得黏稠，不利于酶解反應，所以到達一定時間，糖含量不再增加[16]。

圖1 低聚糖得率與水解時間的關系Fig. 1 Relationship between oligosaccharide content and reaction time

2.1.2 各因素對豌豆纖維粉低聚糖得率的影響

圖2 各因素對豌豆纖維粉低聚糖得率的影響Fig. 2 Effect of various factors on the yield of oligosaccharides from pea fi ber powder

由圖2可知，當料液比為1∶20～1∶35（g/mL）之間時，隨著液體使用量的增加，低聚糖得率增加上升較快。再增加液體使用量時，低聚糖得率下降。從實際生產考慮，料液比選1∶30為中心點。反應溫度從40 ℃升高到50 ℃時，低聚糖得率隨之増加，但當反應溫度高于50 ℃時，低聚糖得率迅速減少，原因是開始時隨著溫度升高能使反應物的能量增加，分子間碰撞的頻率也增加，從而提高酶解速率，但是當溫度過高，超過了酶的最適溫度時，酶活性將降低，導致水解速度下降。酶濃度對低聚糖的降解效果有一定的影響，在酶濃度達到飽和濃度之前，酶解效果隨著酶濃度的升高而增強，而當酶與底物的結合接近飽和時，酶解效果則不再明顯提高[17]。

2.2 回歸模型的建立和檢驗

表2 二次旋轉回歸試驗設計與結果Table 2 Experimental arrangement with response variables

利用SAS9.1軟件對試驗結果（表2）進行分析，得出回歸方程，然后對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗，以檢驗該回歸方程是否擬合真實試驗結果。最后對所得數據做嶺回歸分析，得出最佳酶解工藝參數。

基于試驗方案和結果，建立糖含量的回歸模型，并對模型進行方差分析，分析結果表明，響應面回歸模型達到高度顯著性水平（P＝0.025 2）[18]，回歸方程模型失擬P＝0.454 8＞0.05，不顯著，說明二次模型可以擬合真實的試驗結果。DPPH自由基響應面回歸模型達到高度顯著性水平（P＝0.019 1），回歸方程模型失擬P＝0.595 6＞0.05，不顯著，說明二次模型可以擬合真實的試驗結果。羥自由基響應面回歸模型達到高度顯著性水平（P＝0.008 7），回歸方程模型失擬P＝0.825 2＞0.05，不顯著，說明二次模型可以擬合真實的試驗結果。

糖含量、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的回歸方程如下：

2.3 酶解工藝參數的影響

2.3.1 酶解工藝參數對低聚糖得率的影響

圖3 酶解工藝參數對低聚糖得率的影響Fig. 3 Effect of enzymatic hydrolysis parameters on oligosaccharide content

由圖3可知，在酶解過程中，隨著纖維素酶添加量增加和反應溫度升高，糖含量有增加的趨勢，越過零水平時，糖含量有降低的趨勢，隨著木聚糖酶添加量的增加，糖含量有先增加后降低的趨勢，但隨著液體使用量增加，糖含量呈下降趨勢。隨著反應溫度的升高，纖維素酶和木聚糖酶的酶活力逐漸增加，有利于低聚糖的充分浸出[19]；在反應開始初期，低聚糖的濃度比較低，反應底物濃度較高，酶在反應時受到的抑制作用比較小，酶促反應迅速，酶的作用也越充分，糖得率迅速提高。但是隨著時間延長，底物濃度不斷降低和部分酶在反應過程中的失活以及低聚糖的不斷積累，酶所受到的反饋抑制效應逐漸增強，酶促反應速度減慢，糖得率增加緩慢。但隨著反應溫度升高，低聚糖的含量反而下降，這一方面是由于在一定溫度下低聚糖部分水解所造成的，另一方面是由于超過了纖維素酶和木聚糖酶的酶解最適條件[20]。

2.3.2 酶解工藝參數對DPPH自由基清除率的影響

圖4 酶解工藝參數對DPPH自由基清除率的影響Fig. 4 Effect of enzymatic processing parameters on DPPH radical scavenging capacity

由圖4可知，在酶解過程中，隨著木聚糖酶添加量的增加，糖液的DPPH自由基清除率有增加的趨勢，越過0水平時，DPPH自由基清除率有降低的趨勢，DPPH自由基清除率隨料液比取值、纖維素酶添加量和反應溫度的增加呈現先增加后降低的趨勢。低聚糖具備清除DPPH自由基的能力，且隨著濃度的增加，對DPPH自由基的清除率迅速提升，這一結果與龔思思等[21]研究結果一致。低聚糖羥基上的氫原子很容易被DPPH自由基抽取，從而增加了DPPH自由基的清除率。后來降低是因為隨著酶量增加，導致底物濃度增加，抑制了酶的活性，低聚糖減少，DPPH自由基的清除率也降低。隨著各因素的變化，低聚糖得率有先增加后降低的趨勢，故對DPPH自由基的清除率有類似的趨勢。另外，多數自由基壽命短暫但是反應活性較強，在有機溶劑中，DPPH自由基是一種即使在室溫條件下也能保持穩定的自由基，呈紫色，但是DPPH自由基在抗氧化劑或供氫體出現時，其游離的離子就會被配對，變成DPPH—H，顏色變淺，隨著時間的延長顏色的變淺程度增大[22]。

2.3.3 酶解工藝參數對羥自由基清除率的影響

圖5 酶解工藝參數對羥自由基清除率的影響Fig. 5 Effect of enzymatic processing parameters on hydroxyl radical scavenging capacity

由圖5可知，在酶解過程中，隨著木聚糖酶和纖維素酶添加量的增加，糖液的羥自由基清除率有增加的趨勢，越過0水平時，羥自由基清除率有降低的趨勢，但隨料液比取值的增加，糖液的羥自由基清除率有降低的趨勢，而反應溫度有先增加后降低的趨勢。低聚糖具備清除羥自由基的能力，且隨著濃度的增加，對羥自由基的清除率迅速提升，這一結果與王麗波等[23]研究結果一致。隨著各因素的變化，低聚糖得率有先增加后降低的趨勢，故對羥自由基的清除率有類似的趨勢。另外，羥自由基是化學性質最活潑的一種自由基，具有很高的反應速率，在自由基中，其危害性最大，因此常用清除羥自由基的能力評價一種物質對自由基的清除效果[24]。

2.4 最佳酶解工藝參數選擇及驗證實驗

用嶺回歸尋找最優酶解工藝范圍，以豌豆纖維粉酶解液的低聚糖得率和清除DPPH自由基、羥自由基能力為考察指標，經過嶺回歸尋優得出最佳酶解工藝參數范圍：料液比1∶20.7～1∶24.5（g/mL）、木聚糖酶添加量170.9～176.7 U/g、纖維素酶添加量316.6～320.4 U/g、反應溫度52.1～57.6 ℃。綜合豌豆纖維粉酶解液的低聚糖得率和清除DPPH自由基、羥自由基能力優化結果，在料液比1∶21、木聚糖酶添加量175 U/g、纖維素酶添加量317 U/g、反應溫度55 ℃條件下，豌豆纖維粉酶解液的低聚糖質量分數為（14.68±0.19）%，DPPH自由基清除率為（31.23±0.069）%，羥自由基清除率為（40.2±0.031）%。通過驗證實驗可知：在上述工藝條件下，豌豆纖維粉酶解液的低聚糖得率和清除DPPH自由基、羥自由基能力均符合嶺回歸尋優結果。

2.5 低聚糖得率、DPPH自由基和羥自由基清除率的相關性分析

典型相關性分析用來考察2 個變量相互變化的關聯關系，變量之間沒有因果關系[25]。使用SAS軟件的CANCORR程序分析低聚糖得率、DPPH自由基和羥自由基清除率的相關性，低聚糖得率與DPPH自由基清除率典型相關系數為0.336 3（P＝0.048 7），表明2 個變量之間存在低正相關關系，即隨著低聚糖得率增加，DPPH自由基清除率有增加的趨勢。低聚糖得率與羥自由基清除率典型相關系數為0.683 6（P＝0.035 8），表明2 個變量之間存在高度正相關關系，即低聚糖得率增加，羥自由基清除率有增加的趨勢。

2.6 特性分析

2.6.1 吸附脂肪的能力

表3 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維、低聚糖對脂肪的吸附能力Table 3 Fat adsorption capacity of pea fi ber, insoluble dietary fi ber and oligosaccharides

表4 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維的持水性和膨脹性Table 4 Water retention capacity and swelling power of pea fi ber and insoluble dietary fi ber

持水性是衡量膳食纖維功能的一項重要指標，其自身結構中含有大量的親水性基團，因此具有很強的吸水性。由于纖維來源及純度的不同，其變化范圍在自身質量的1.2～25 倍左右[26]。由表4可知，豌豆纖維粉和膳食纖維都具有良好的持水性和膨脹性，豌豆纖維粉高于Hasnaoui等[27]報道的石榴皮中纖維持水力3.53 g/g，高于李娜等[28]報道的大豆原料中膨脹性為7.1 mL/g。

2.7 電子顯微鏡掃描分析

圖6 3 種物質的掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron micrographs of pea fi ber, insoluble dietary fi ber and oligosaccharides

如圖6所示，豌豆纖維粉表面呈現凹凸不平，纖維束狀清晰可見，為纖維的原始狀態，呈片狀多孔結構[2]。不可溶膳食纖維的空間網絡較明顯，呈現蜂窩狀。低聚糖呈現不規則形狀，表面圓滑，無棱角，中間多孔洞[14]。

2.8 熱力學性質

圖7 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維和低聚糖的差示掃描量熱結果Fig. 7 DSC curves of pea fi ber powder, insoluble dietary fi ber and oligosaccharides

表5 豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維和低聚糖的差示掃描量熱分析結果Table 5 DSC parameters of pea fi ber powder, insoluble dietary fi ber and oligosaccharides

由圖7和表5可知，豌豆纖維粉、不可溶膳食纖維、低聚糖的焓變大小順序為豌豆纖維粉＞不可溶膳食纖維＞低聚糖，豌豆纖維粉經木聚糖酶、纖維素酶的降解將纖維分解為纖維二糖和纖維寡糖，分子鏈斷裂變短[29]，熱穩定性降低，而低聚糖是2～10 個相同或不同的單糖聚合而成，分子鏈較不可溶膳食纖維更短，熱穩定性降低[30]。

2.9 酶解液中低聚糖的組分分析

圖8 低聚糖色譜圖Fig. 8 Chromatogram of oligosaccharides

由圖8可知，豌豆纖維粉去除淀粉和蛋白質得到的不可溶膳食纖維，通過纖維素酶和木聚糖酶的酶解作用所得的酶解液低聚糖樣品為混合物，與標準圖譜出峰時間相比較，可知該低聚糖混合物主要含有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖。

3 結 論

以豌豆纖維粉為原料，采用酶解的方法，水解時間36 h，pH 5，料液比1∶20.7～1∶24.5（g/mL），木聚糖酶添加量170.9～176.7 U/g，纖維素酶添加量316.6～320.4 U/g，反應溫度52.1～57.6 ℃。在優化的酶解工藝參數范圍的條件下，豌豆纖維粉酶解液的最優低聚糖得率為13.98%～15.02%。

低聚糖具有清除自由基的能力，在優化的酶解工藝參數范圍的條件下，DPPH自由基清除率為30.56%～33.21%，羥自由基清除率為39.36%～42.44%。

低聚糖對飽和脂肪和不飽和脂肪均具有一定的吸附能力，吸附能力大小為不飽和脂肪＞飽和脂肪；豌豆纖維粉和膳食纖維也都具有良好的持水性和膨脹性；豌豆低聚糖對高溫具有良好的穩定性，短時間加熱比較穩定。

酶解豌豆纖維粉所得的低聚糖主要組分為阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖。

酶水解豌豆纖維粉使豌豆纖維得以利用，制備的膳食纖維低聚糖不僅具有一定抗氧化能力，還具有良好的持水性和膨脹性，對脂肪有一定的吸附作用。從電鏡下觀察，豌豆膳食纖維表面呈現凹凸不平，纖維束狀清晰可見，呈片狀多孔結構。對熱有較好的穩定性，可用于食品、飼料等行業的加工生產。