血清COL4A3蛋白與非小細胞肺癌(NSCLC)患者臨床病理特征及預后的相關性

胡安邦 李衛青 洪國岱 蘇 琳 鄒純樸 陳 曉 焦肖寧 朱楊壯壯 胥孜杭

(1上海中醫藥大學深圳醫院-深圳市羅湖區中醫院呼吸病科 深圳 518001; 2深圳市羅湖區人民醫院中醫科,3腫瘤科 深圳 518001; 4上海中醫藥大學基礎醫學院內經教研室 上海 201203)

近年的流行病學統計結果顯示,無論是在發達國家還是在發展中國家的發達地區,肺癌已成為發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1-2],其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的類型,約占80%～85%[3]。肺癌起病隱匿,難以早期診斷,往往確診時已處于晚期,5年生存率極低。除了常規的手術、放療、化療以外,分子靶向治療越來越受到關注。

Ⅳ型膠原蛋白α3(collagen type Ⅳ alpha 3,COL4A3)屬于Ⅳ型膠原蛋白家族,該基因與腎臟疾病和多種腫瘤密切相關。COL4A3基因位于人染色體2q36-q37上,含有52個外顯子,編碼產物為8 114 bp的mRNA和162 000的蛋白質[4]。COL4A3的分布僅限于具有組織特異性的基底膜,如腎小球基底膜、耳蝸基底膜、前晶狀體囊的眼基底膜、Descemet膜、卵巢和睪丸基底膜,以及肺泡毛細血管基底膜[5]。2000年,人類COL4A3的NC1結構域被制成重組蛋白,命名為“tumstatin”,可抑制毛細血管內皮細胞的增殖和血管形成,并誘導內皮細胞特異性凋亡[6],還可抑制小鼠異種移植模型中人腎細胞癌和前列腺癌的生長[7]。Ⅳ型膠原蛋白具有細胞黏附功能,參與乳腺癌[8]、胃癌[9]、肺癌[10]、急性骨髓性白血病、胰腺導管腺癌、卵巢癌[11]、肝癌[12]、膀胱癌[13]等多種不同腫瘤的侵襲和轉移。在腎臟腫瘤中,COL4A3基因持續高表達可誘導間充質干細胞參與腫瘤基質重塑,加速腫瘤發展進程。在分化良好的肺腫瘤中,其腫瘤簇周圍也可檢測到COL4A3高表達[14]。本研究旨在探討血清COL4A3蛋白表達與NSCLC患者臨床病理及預后的相關性,其對NSCLC細胞生長、侵襲及轉移的作用,可否作為NSCLC患者預后不良的獨立標志物,以期為肺癌精準治療提供依據。

資料和方法

研究對象收集2005年至2017年就診于深圳市羅湖區人民醫院和羅湖區中醫院的NSCLC患者,共計90例,其中男性60例,女性30例,年齡31～86歲,平均55歲。納入標準:(1)符合美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network,NCCN) NSCLC治療指南(2017年第2版)中的診斷標準,以及腫瘤-淋巴結-轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分期;(2)至少有1個明確可測量的病灶(10 mm);(3) Karnofsky (KPS)≥60分,預計生存期≥3個月;(4)受試者簽署知情同意書。排除標準:不符合上述納入標準的肺癌患者;妊娠期或哺乳期患者;合并有心血管、腎和造血、免疫系統等嚴重原發性疾病、精神病等影響療效與安全性判斷的患者;失訪病例。另擇58名健康人作為對照組。

標本采集與檢測采集患者空腹晨血3 mL,離心后使用COL4A3 ELISA試劑盒(美國Aviva Systems Biology公司),參照說明書進行檢測。

細胞培養A549細胞購自中國科學院上海細胞庫,采用DMEM培養基(美國Gibco公司),含有100 U/mL青霉素-鏈霉素(美國Hyclone公司)和10%胎牛血清(美國Gibco公司),在37 ℃、5%CO2中培養。

MTT法檢測細胞增殖將A549細胞消化后以3 000個/孔的密度接種于96孔板。貼壁過夜后吸去原有培養液,加入含不同濃度COL4A3 (5和10 μg/mL)的完全培養液。分別在干預1、3、5、7天后加入MTT試劑。置于37 ℃孵育4 h,棄去上清,每孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)溶解甲瓚顆粒,使用酶標儀檢測490 nm處吸光度(D)。

Transwell實驗使用8 μm Transwell過濾器(美國BD公司)測定纖維蛋白原(美國Sigma公司)對細胞遷移和侵襲的影響。將含/不含Matrigel(美國BD公司)涂布的膜放置于上室,然后將0.5 μL無血清DMEM培養基中的A549細胞(3×104)加入其中。對處理組COL4A3(5和10 μg/mL)進行相同操作。下室填充500 μL含有10%胎牛血清的基礎培養基。在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后,遷移至下部隔室的細胞用甲醇固定,并用結晶紫染色。在每孔隨機選擇的區域內以100×放大率進行成像和細胞計數。

克隆形成實驗A549細胞消化后以500個/孔接種于6孔板。貼壁過夜后吸去培養液,加入含不同濃度COL4A3(5和10 μg/mL)的完全培養液。培養7天后,使用4%多聚甲醛室溫固定30 min,加入結晶紫染料染色20 min。清洗后于倒置顯微鏡下觀察克隆形成數目,并拍攝顯微成像圖像。

統計學處理使用SPSS 20.0軟件統計分析數據,Mann-Whitney U檢驗統計分析血清COL4A3水平與患者臨床病理特征的關系,Kaplan-Meier分析血清COL4A3水平與患者生存期的關系,ROC曲線分析血清COL4A3水平預測NSCLC患者腫瘤轉移的敏感性與特異性。P<0.05為差異有統計學意義,P<0.01為差異有顯著統計學意義。

結 果

血清COL4A3水平與NSCLC患者臨床病理特征的關系90名NSCLC患者的血清COL4A3水平為(4.21±1.14) μg/L。對照組血清COL4A3水平為(2.75±0.64) μg/L,患者與健康人的血清COL4A3水平差異有顯著統計學意義(P<0.001)。評估NSCLC患者的臨床病理特征:性別、年齡、吸煙、組織學類型、腫瘤大小、病理分級、淋巴轉移、癌癥階段及血清COL4A3水平。血清COL4A3水平與臨床病理參數的相關性參見表1,其中性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理分級、淋巴轉移及臨床分期的比較采用獨立樣本t檢驗,而組織學類型的比較采用單向ANOVA檢驗。血清COL4A3水平與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、病理分級及組織學類型均無關;而與淋巴結轉移(P=0.002)和臨床分期(P=0.001)相關。

表1 NSCLC患者凝血變量與臨床病理特征的相關性Tab 1 Correlation between coagulation variables and clinicopathological characteristics in NSCLC patients

血清COL4A3 預測NSCLC患者腫瘤轉移及其對生存時間的影響從NSCLC患者血清COL4A3的ROC曲線分析中的最佳截斷值預測患者腫瘤轉移的敏感性(圖1)。當血清COL4A3為4.13 μg/L時,敏感性為76.2%,特異性為65.4%,AUC為0.731 (P<0.001,95%CI:0.673～0.837),對患者臨床分期具有潛在的預測價值(圖1A)。在90例NSCLC患者中,中位血清COL4A3水平為4.13 μg/L,COL4A3高表達與COL4A3低表達的患者相比,生存期差異有統計學意義(P=0.021),低表達患者的存活時間更長(圖1B)。

單/多因素分析CO1L4A3與肺癌預后相關的因素單因素分析結果顯示,患者OS與腫瘤大小、病理組織分級、淋巴結轉移、臨床分期以及血清COL4A3水平密切相關;多因素分析結果顯示,患者淋巴結轉移情況、臨床分期以及血清COL4A3水平與肺癌預后密切相關(P<0.05,表2)。提示血清COL4A3水平可能是肺癌患者OS的獨立預測因子。

A:Clinical stage was predicted by ROC curve analysis of serum COL4A3 in patients with NSCLC,and the optimal cutoff value of COL4A3 concentration was 4.13 μg/L.B:OS of 90 patients was showed by Kaplan-Meier curve (P=0.021).
圖1 血清COL4A3的ROC分析預測臨床分期及其對生存期的影響
Fig 1 ROC analysis of serum COL4A3 predicted clinical stage and its effect on overall survival

表2 單因素和多因素分析預測NSCLC患者預后情況Tab 2 Univariate and multivariate analysis of prognostic valuables for overall survival

COL4A3促進NSCLC細胞增殖和轉移血清COL4A3高表達與NSCLC患者不良預后的相關性較強。用MTT實驗檢測人NSCLC細胞株A549的增殖情況,發現低濃度COL4A3(5 μg/mL)可促進細胞增殖,高濃度COL4A3(10 μg/mL)促進細胞增殖的作用更強(圖2A)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示,COL4A3對A549細胞增殖的促進作用呈濃度依賴性,即濃度越高促進作用越明顯(圖2B)。Transwell實驗發現,COL4A3對A549細胞轉移的抑制作用有明顯的濃度依賴趨勢(圖2C)。

討 論

COL4A3基因高表達與多種疾病相關,如Alport綜合征、節段性腎小球硬化、2型糖尿病、高原紅細胞增多癥及阿爾茲海默癥等,其也是多種腫瘤發生發展的風險基因[15-17]。COL4A3屬于Ⅳ型膠原蛋白家族成員,Ⅳ型膠原蛋白在細胞外基質-基底膜(basal membrane,BM)的形成和維持中發揮重要作用,是構成BM的主要成分和骨架。當腫瘤細胞發生轉移時必須穿透上皮細胞BM以及圍繞血管的BM,故腫瘤細胞分泌的Ⅳ型膠原蛋白酶可溶解Ⅳ型膠原蛋白,是腫瘤細胞侵襲和轉移的重要環節[18]。COL4A3作為Ⅳ型膠原蛋白家族成員,其過度表達被認為與多種惡性腫瘤的轉移、侵襲密切相關[19-20]。在腎癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤患者血清中可檢測出COL4A3高表達,其與腫瘤大小、淋巴管侵襲、靜脈侵襲和TNM分期等腫瘤進展的指標呈現正相關[21-23]。在使用順鉑和吉西他濱化療的NSCLC患者中,COL4A3低表達患者的中位OS明顯高于COL4A3高表達患者[24]。但是COL4A3影響NSCLC腫瘤進程的具體機制目前尚無報道,其可否成為NSCLC的診斷標志物有待進一步研究。

本研究臨床數據顯示健康人與NSCLC患者血清COL4A3存在顯著差異,NSCLC患者血清COL4A3表達水平明顯增高,高表達組(>4.13 μg/L)的OS明顯低于低表達組(<4.13 μg/L)(P<0.05)。在NSCLC患者的臨床病理特征中,淋巴結轉移和臨床分期都與COL4A3表達密切相關:淋巴結轉移患者血清COL4A3水平明顯高于無轉移患者(P<0.05),臨床分期Ⅰ、Ⅱ期患者血清COL4A3水平明顯低于Ⅲ、Ⅳ期患者(P<0.05)。說明COL4A3的表達水平與NSCLC患者腫瘤進展程度呈正相關。單、多因素分析NSCLC預后相關因素的結果發現,COL4A3水平與NSCLC預后密切相關,提示血清COL4A3高表達的NSCLC患者可能預后不良。COL4A3高表達可加快NSCLC發展進程。實驗室研究發現,COL4A3可明顯促進NSCLC細胞生長、增殖,并呈濃度依賴趨勢;COL4A3可明顯提高NSCLC細胞的侵襲性,增強其轉移能力,具有濃度依賴傾向,初步揭示COL4A3高表達可促進NSCLC細胞增殖、侵襲轉移。

雖然COL4A3基因在Alport綜合征等疾病中報道頗多,但其在腫瘤尤其在肺癌中的報道并不深入。目前肺癌治療仍以鉑類化療藥為主[25],因其嚴重的不良反應和耐藥性成為提高療效的瓶頸,腫瘤的精準療法已成為研究熱點[26-27]。血清COL4A3水平與NSCLC進展密切相關,可能是一種NSCLC患者預后不良的獨立標志物。COL4A3能顯著促進肺癌細胞的增殖和轉移,有望成為NSCLC治療的新靶點,其具體的分子作用機制有待進一步明確。