對硫磷納米抗體篩選及分子識別機制研究

張玉琪 張瑾如 王鋒 李家冬 司睿 呂麗珊 沈玉棟 王弘 HAMMOCK Bruce D 孫遠明

摘 要 ：對硫磷是一種廣譜的有機磷酸酯類殺蟲、殺螨劑， 毒性極強， 可對環境和人類健康造成嚴重危害。盡管我國已禁止使用對硫磷， 但仍存在違禁使用現象， 加強對其監測十分必要。納米抗體是已知最小的與抗原結合的片段（15 kDa）， 來源于駱駝科動物體內重鏈抗體的可變區， 具有穩定性強、靈敏度高、易表達、水溶性好等特性。本研究基于噬菌體展示技術構建了抗對硫磷納米抗體庫， 其庫容為2.41 × 107 cfu/mL， 經抗原抗體固相親和篩選及噬菌體酶聯免疫法（Phage ELISA）鑒定， 獲得5種抗對硫磷納米抗體VHH1、VHH6、VHH13、VHH21和VHH24。以結合能力最強的VHH1為基礎， 采用同源建模和分子對接技術探討VHH1與對硫磷分子的識別機制， 發現VHH1與對硫磷存在氫鍵和疏水間分子作用力， 關鍵氨基酸是Ser60、Lys104、Phe105、Gly106和Arg107。本研究為抗體的進化改造和半抗原的設計提供了新思路。

關鍵詞 ：納米抗體; 對硫磷; 噬菌體展示; 分子模擬

1 引 言

對硫磷是一種廣泛使用的有機磷酸酯類農藥，具有高毒性、持久性，可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，導致體內神經遞質乙酰膽堿的大量堆積，從而引起一系列的中毒反應[1]。我國從2007年開始禁止使用對硫磷，但誤用、濫用和違禁使用的現象仍時有發生[2～6]。因此，對其加強監測十分必要。

檢測對硫磷的免疫分析試劑主要包括傳統抗體（多克隆抗體和單克隆抗體）、重組抗體片段（單鏈抗體（Singlechain variable fragment，scFv）和抗原結合片段（Antigenbinding fragment，Fab））和噬菌體展示多肽[7～11]。納米抗體是來源于駱駝科動物的重鏈抗體的重鏈可變區域，是一種獨特的基因工程抗體，與傳統抗體相比，具有穩定性強、易表達、易于基因工程操作、靈敏度高等特性[2]。目前，采用納米抗體檢測的小分子污染物主要包括毒素類（微囊藻毒素，赭曲霉毒素，黃曲霉毒素，嘔吐毒素，橘青霉素）、激素類、有機污染物及農藥類（嘧菌酯，毒莠定）[3～18]。Pírezschirmer等[6]利用固相篩選獲得寬譜特異性的抗微囊藻毒素（Microcystins）的納米抗體（Variable domain of the H chain of heavychain antibodies，VHH）A2.3，建立的ELISA半數抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.28 μg/L。 Liu等[9]以OTAKLH免疫羊駝，構建了2×107 cfu/mL的納米抗體庫，采用固相親和篩選獲得抗OTA的靈敏的VHH28，其phageELISA和免疫PCR法的IC50為0.31 ng/mL和3.7 pg/L，檢測效果良好。Bever等[20]將VHH于95 ℃熱擊10和60 min后，納米抗體仍具有約65%和30%的活性，而相同條件下的多克隆抗體則失去活性。納米抗體水溶性好，不易聚集趨勢，這可能是由于骨架區FR2的疏水性氨基酸替換為親水性氨基酸（V37F或V37Y，G44E，L45R和W47G），該區域在VH通常與VL區域結合，且進化過程中非常保守[21]。

分子模擬技術為抗體與小分子識別機制的研究提供了一條途徑，同時也為抗體的分子進化提供了理論依據[22]。Qiu等[23]利用同源建模和分子對接技術證實VHH 28的CDR3區Thr102與抗嘔吐毒素抗體（antiDON antibody）形成氫鍵，起著關鍵的結合作用。Jiao等[24]使用分子模擬獲得結合5種Cry1毒素（Cry1Aa，Cry1Ab，Cry1B，Cry1C和Cry1E）的VHH A8 CDR3區的關鍵氨基酸，分別為第105位天冬酰胺、第106位精氨酸、第107位纈氨酸和第114位精氨酸。

目前，有關對硫磷的納米抗體尚未見報道。本研究采用對硫磷結構類似物H1KLH抗原免疫羊駝，構建噬菌體展示納米抗體庫，基于固相親和篩選獲得特異性識別對硫磷的納米抗體。分析了納米抗體的氨基酸序列特性，通過同源建模和分子對接方法，探討納米抗體與對硫磷分子的識別機制，為后期抗體的進化改造和半抗原的設計提供參考。

拉氏圖可用于分析蛋白質骨架結構，氨基酸殘基的二面角（φ， ψ）歸屬于拉式圖的不同區域對應不同的結構，且結構穩定性也不同[31]。拉氏圖的結果主要分成4個區域：紅色的核心區域（Most favoured regions）[A， B， L]、黃色的額外允許區（Additional allowed regions）[a， b， l， p]、淺黃色的大致允許區（Generously allowed regions）[～a， ～b， ～l， ～p]及空白的禁阻區（Disallowed regions）。VHH1模型的拉氏圖顯示（電子版文后支持信息圖S1A），氨基酸的二面角坐標點100%落在有利的區域（核心區域占92.5%，額外允許區占6.6%，大致允許區占0.9%）。根據拉氏圖評分標準（>90%的氨基酸落在核心區域），認為VHH1的模型是合理的，此模型可用于后續研究。

ERRAT指標（電子版文后支持信息圖S1B）解釋了0.35 nm范圍內，不同原子類型對之間形成的非鍵相互作用的數目（側鏈），理論上，得分>85分比較好，VHH1模型得分85.97，符合要求。

用Verify3D模塊（電子版文后支持信息圖S1C）對模型的三維結構與任一氨基酸序列的兼容性進行評分[32]，結果表明，91.06%殘基的3D1D分值≥0.2，超過合格線80%，說明模型具有較好的可靠性。