雞奇異變形桿菌的分離與鑒定

師清博 何勇君

摘 要 某養(yǎng)殖戶，雞只發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的疾病，通過臨床癥狀觀察、病理剖檢、細(xì)菌學(xué)檢查以及分子生物學(xué)診斷，綜合確診為雞奇異變形桿菌病。

關(guān)鍵詞 奇異變形桿菌；分離與鑒定；16S r RNA

奇異變形桿菌（ Proteus mirabilis）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，廣泛分布于自然界，常見于污水、土壤與堆肥中，極易污染肉、蛋、禽類等食物，繁殖速度快，可引起食物中毒、泌尿道感染等[1]。奇異變形桿菌是一種條件性致病菌，可存在于人和動(dòng)物體表、黏膜及消化道，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，可感染人和動(dòng)物，引起尿道炎、中耳炎、菌血癥及腹瀉等癥，嚴(yán)重時(shí)可致死[2]。近年來由于一些養(yǎng)殖戶濫用抗菌藥的現(xiàn)象不斷增多，殺滅了消化道中的正常菌群，破壞了微生態(tài)平衡，導(dǎo)致該菌異常增殖，產(chǎn)生大量毒素，并引起腹瀉等癥。隨著飼養(yǎng)量的增加，一旦發(fā)生感染，會(huì)給養(yǎng)殖戶造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。本文對某養(yǎng)殖場發(fā)生的一起奇異變形桿菌病進(jìn)行研究和報(bào)道，以便為該病的診治提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.2 試驗(yàn)試劑 普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等均按常規(guī)方法配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 通過詢問畜主，了解發(fā)病情況。

1.2.2 病理剖檢變化 對病死雞進(jìn)行剖檢，肉眼觀察各組織器官的病理變化。

1.2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采取肝臟直接劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。

1.2.4 分子生物學(xué)診斷

1.2.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的細(xì)菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)一對通用引物[3]，引物名稱與序列見表1。

1.2.4.2 細(xì)菌基因組的提取 將細(xì)菌接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床（300r/ min）培養(yǎng)過夜，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行細(xì)菌基因組的提取。

1.2.4.3 細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增 以細(xì)菌基因組DNA為模板，XJTY-F和XJTY-R為上下游引物，對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL反應(yīng)體系：2×Taq酶預(yù)混液10μL，滅菌去離子水8μL，上、下游引物各0.5μL，模板DNA1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸5min。取10μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于自動(dòng)凝膠成像儀上觀測結(jié)果。剩余PCR產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.4 16S rRNA 基因序列測定與分析 PCR產(chǎn)物由上海生物股份有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)調(diào)查

某養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)蛋雞60只，剛開始有4-5只陸續(xù)發(fā)病，開始表現(xiàn)精神不振，食欲減退，后以腹瀉為主。應(yīng)用頭孢類藥物治療可以暫時(shí)收到效果，但停藥后復(fù)發(fā)。雖經(jīng)多方治療，但發(fā)病雞仍以全部死亡而告終。

2.2 病理剖檢變化

剖檢可見肝臟出血，脾臟、腎臟顯著腫大、出血，胃粘膜出血，腸粘膜呈彌散性出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

分離菌株在血瓊脂平板上培養(yǎng)16h，可見灰白色中等大小菌落，表面光滑，蔓延生長，有臭味；在麥康凱培養(yǎng)基中，可見半透明圓形扁平生長的大菌落，表面光滑濕潤，沒有蔓延生長。培養(yǎng)特性疑似奇異變形桿菌。

2.4 分子生物學(xué)診斷結(jié)果

以提取的分離菌株基因組為模板，XJTY-F、XJTY-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)出一約1500bp的特異性片段（圖1）。PCR產(chǎn)物序列測定結(jié)果提交到GenBank，與GenBank中相關(guān)序列的BLAST比較，結(jié)果表明與奇異變形桿菌菌種的同源性高達(dá)99.0%，可判定此分離菌株為奇異變形桿菌。

3 分析與討論

奇異變形桿菌是一種條件性致病菌，但近年來由于一些養(yǎng)殖戶濫用抗菌藥的現(xiàn)象不斷增多，殺滅了消化道中的正常菌群，破壞了微生態(tài)平衡，導(dǎo)致該菌異常增殖，產(chǎn)生大量毒素，并引起腹瀉等癥。尤其發(fā)生其他疾病時(shí)更容易繼發(fā)或混合感染。其作為人畜共患傳染病原更應(yīng)該引起重視[5]。

據(jù)報(bào)道，雞發(fā)生奇異變形桿菌感染時(shí)機(jī)體中B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞減少，機(jī)體免疫功能下降，由此導(dǎo)致疾病的惡性發(fā)展或患病動(dòng)物發(fā)生繼發(fā)感染而死亡[6]。因此，奇異變形桿菌感染引起的動(dòng)物免疫力降低也是加重病情的原因之一。

本此報(bào)道的病例早期應(yīng)用頭孢類藥物治療后雖取得了一定療效，但停藥后易復(fù)發(fā)，雖然采取了多種治療措施，但最終仍未能控制病情。據(jù)報(bào)道，該菌對多數(shù)藥物具有耐藥性，這與其攜帶的R質(zhì)粒有關(guān)[7]，所有奇異變形桿菌均有R質(zhì)粒，因而該菌具有很強(qiáng)的耐藥性[8，9]。鑒于此，在治療奇異變形桿菌感染時(shí)科學(xué)用藥顯得尤為重要。奇異變形桿菌存在于人和動(dòng)物的腸道中，濫用抗菌藥容易破壞腸道中的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致該菌異常增殖，產(chǎn)生大量毒素，并引起腹瀉等疾病[9]，因此，長期不科學(xué)地使用抗菌藥物，不但使得該菌的病原性變得更加突出，同時(shí)也會(huì)相應(yīng)地增加疾病的治療難度。當(dāng)臨床發(fā)生奇異變形桿菌感染時(shí)，最好依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)用藥。

本實(shí)驗(yàn)主要采用16S rRNA序列分析檢測奇異變形桿菌的技術(shù)，更加精確、簡便。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測結(jié)果進(jìn)行比較， PCR方法能準(zhǔn)確檢測出雞奇異變形桿菌，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)時(shí)PCR方法不僅能夠快速、準(zhǔn)確地地鑒定變形桿菌，還可以進(jìn)一步量化細(xì)菌[10]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[2] 王承東，李德生，湯純香，等.大熊貓生殖道感染奇異變形桿菌一例[J].四川動(dòng)物，2007，26（1）： 167.

[3] 沈永才，袁佩娜.利用16 S rRNA的PCR法鑒定雙歧桿菌[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2001， 21（5）：578- 579.

[4] 歐陽琨.變形桿菌的病原性及其分析[J].中國獸醫(yī)雜志，1987，13（7）：49-50.

[5] 侯玉澤，龍塔，程相朝.實(shí)驗(yàn)性雞奇異變形桿菌病免疫活性細(xì)胞的變化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，9：31-33.

[6]王云，朱毓蘭.不同因素對奇異變形桿菌（PM10）R質(zhì)粒消除的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1994，6（1）：35-37.

[7] 歐陽琨.變形桿菌的病原性及其分析[J].中國獸醫(yī)雜志，1987，13（7）：49-50.

[8] 諶南輝，鄧舜洲.珍禽源奇異變形桿菌分離株微生物學(xué)特征研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（4）：241-244.

[9] 李文建.奇異變形桿菌的毒力因子[J].中國人獸共患病雜志，2001，17（2）：80-83.

[10] Weiwei Zhang & Zongliang Niu & Kun Yin & Ping Liu&Lingxin Chen.Quick identification and quantification of Proteus mirabilis by polymerase chain reaction （PCR） assays[J].Springer-Verlag.2013.（63）：683–689.

作者簡介：師清博（1991-），女，碩士研究生，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病防控工作。