CL-PEG-MnFe2O4納米膠束介導的腫瘤微血管和微淋巴管雙重靶向MR成像

楊華，龔明福，鄒利光，曾國飛，方玉，劉翠芳

1.重慶市中醫院放射科，重慶400021；2.第三軍醫大學新橋醫院放射科，重慶400037

前言

近年來，隨著靶向治療、生物治療及化療等各種治療手段的不斷進步，惡性腫瘤的五年生存率不斷提高，但腫瘤一旦發生了轉移，其遠期治療效果將大大減低，因此，準確的發現或預測腫瘤轉移風險對腫瘤治療手段的選擇及預后的判斷具有重要意義［1-2］。部分惡性腫瘤的轉移同時存在血行和淋巴道兩個轉移途徑，顯然，此類腫瘤如果只針對一種轉移途徑進行干預將會大大影響患者的預后［3-4］。研究發現［5］：惡性腫瘤內血管的新生或淋巴管的新生與腫瘤的惡性程度及轉移風險具有明顯的相關性，如能通過影像手段在活體內同時檢測腫瘤的新生血管和新生淋巴管將會給腫瘤的治療帶來重大意義。磁共振分子影像的出現為靶向腫瘤血管及淋巴管顯像提供了一種分辨率高、無創且較敏感的影像檢查方法。在過去的20年中，靶向腫瘤血管顯像的研究取得了長足的進展，然而，針對腫瘤血管及淋巴管雙重靶向顯像的研究卻罕見報道。前期，筆者合成了靶向Endoglin的CL-PEG-MnFe2O4納米膠束，體外實驗表明CL-PEGMnFe2O4納米膠束能與腫瘤源性血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞特異性結合［6］。本研究中筆者擬將CLPEG-MnFe2O4納米膠束應用于裸鼠乳腺癌移植瘤模型并進行MR成像，探索基于磁共振納米探針顯示腫瘤新生血管及新生淋巴管的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

4～5周齡健康雌性BALB/C裸鼠12只（購自第三軍醫大學新橋醫院實驗動物中心），MDA-MB-231乳腺癌細胞由第三軍醫大學生物化學與分子生物學教研室惠贈。CL-PEG-MnFe2O4和PEG-PCL-MnFe2O4納米膠束為自制［6-7］。胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司，小鼠抗人CD34單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP、兔抗人CD105抗體、山羊抗兔IgG-HRP、鼠抗人Podoplanin單克隆抗體及山羊抗鼠IgG-HRP等免疫組化試劑均購自美國Abcam公司，DAB顯色液購自上海碧云天公司。光學顯微鏡為日本奧林巴斯公司產品，TCSSP5激光共聚焦顯微鏡為德國萊卡公司產品，3.0 T 磁共振成像儀（Signa HDx）及正交小動物線圈來自美國GE公司。

1.2 裸鼠移植瘤模型的建立

收集處于對數生長期乳腺癌MDA-MB-231 細胞，PBS 重懸配制成細胞濃度為5×107/mL 的細胞懸液。選取裸鼠大腿根部皮下為種植部位，以1 mL 注射器緩慢注射0.2 mL 的細胞懸液，注射過程中防止細胞懸液滲漏。裸鼠細胞接種后置于SPF 級動物房內飼養，定期觀察、記錄移植瘤生長情況，待腫瘤直徑長到1.0 cm進行下一步實驗。

1.3 移植瘤的MR成像

10只裸鼠移植瘤模型隨機分為實驗組和對照組，每組5只。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。俯臥位固定在小動物專用正交線圈內，3.0 T磁共振進行軸位平掃及靶向增強掃描。掃描參數：平掃SE-T1WI（TR/TE=380 ms/14 ms）；FSE-T2WI（TR/TE=3 000 ms/65 ms）；GRE T2*WI（TR/TE=540 ms/10 ms,FA=20°）；八回波T2mapping（TR/TE=2 400 ms/13.7、27.4、41.1、54.8、68.6、82.3、96.0、109.7 ms）。平掃結束后行靶向增強掃描，經球后靜脈注射鐵濃度為50 μg/mL納米粒，方法參考筆者前述報道［8］。實驗組為靶向Endoglin的CL-PEG-MnFe2O4納米膠束，對照組為非靶向的PEG-PCL-MnFe2O4納米膠束，總量均為0.15 mL。整個穿刺和注藥過程盡量保證裸鼠移植瘤位置不動，除T1WI序列外，增強掃描的其余序列、位置及參數與平掃相同。分別于對比劑注射后0、5、15、30、60及120 min掃描。選取不同時間點相同層面腫瘤圖像同一位置進行信號強度（Signal Intensity,SI）測量，感興趣區（Region Of Interest,ROI）大小為10 mm2，并計算信號強度變化率（△SI）：△SI=（SI增-SI平）/SI平×100%，其中SI平和SI增分別為腫瘤平掃和增強后的信號強度。繪制時間-△SI曲線（Time-Intensity Curve,TIC），觀察曲線的特征，分析信號變化規律。T2mapping獲取圖像導入ADW 4.5工作站進行后處理，在T2mapping偽彩圖測量腫瘤的T2值和R2值，評價靶向CL-PEG-MnFe2O4納米膠束增強效能。MRI掃描結束后，摘取腫瘤，盡可能在MRI掃描層面切開標本，分別行HE 染色、普魯士藍染色、CD34、CD105 及Podoplanin免疫組化染色，倒置顯微鏡下觀察攝片。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，先進行正態分布檢驗及方差齊性檢驗，根據方差齊性檢驗結果采用配對資料t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠乳腺癌移植瘤Endoglin靶向MR成像

靶向Endoglin 的CL-PEG-MnFe2O4探針注射后0及5 min，在FSE T2WI序列腫瘤實質呈明顯的負性增強，腫瘤周邊區增強明顯，此后強化逐漸減弱，強化范圍逐漸減小，1 h的時候，腫瘤呈周邊區斑點狀強化（圖1a～d），TIC 呈下降-上升-平臺型（圖2a）；而注射非靶向的PEG-PCL-MnFe2O4納米膠束后早期實質強化特點與CL-PEG-MnFe2O4相似，但消退更快，在1 h時腫瘤信號強度幾乎恢復到平掃狀態（圖1e～h），TIC呈下降-上升型(圖2a)。腫瘤增強區域病理組織普魯士藍染色見大量藍染顆粒，相應區域CD105、CD34及Podoplanin 免疫組化染色顯示局部血管及淋巴管豐富（圖1i～l）。

圖1 裸鼠乳腺癌移植瘤靶向增強T2WI圖像Fig.1 Targeted and enhanced T2-weighted images of breast cancer xenografts in nude mice

2.2 裸鼠乳腺癌移植瘤靶向增強后T2值和R2值變化

兩組腫瘤實質對比劑注射前、后的T2值及R2值見表1，可見CL-PEG-MnFe2O4組在注射后0 min T2值明顯縮短，R2值明顯增高，T2值變化幅度約42.3%，此后逐漸恢復。60 min后T2值和R2值趨于恒定。2 h后T2仍維持在22.9%左右，而PEG-PCL-MnFe2O4在15 min內迅速回升，60 min后T2值和R2值恢復到納米粒注射前水平（圖2b）。

3 討論

分子影像的出現為疾病（尤其是腫瘤）的精確診斷和精準治療提供更為可靠的輔助工具，磁共振分子影像由于具有無創、信噪比及軟組織分辨率高和可重復的優點被認為是未來分子影像發展的主要方向［9-11］。但敏感性一直是制約磁共振分子影像發展的難點，探尋更加敏感的磁共振顯像對比劑是學術界研究的熱點。金屬納米粒子的出現為磁共振分子影像的突破帶來新的希望，近年來，伴隨著納米粒合成技術不斷進步，更多超敏感金屬氧化物被優選出來，同時，包被材料及表面修飾材料的不斷更新，納米粒的水溶性、生物相容性及靶向性能逐漸提升，為磁共振分子影像的臨床應用打下了堅實的基礎［12-13］。MnFe2O4納米粒由于具有易于反磁化的特性，相對其他鐵酸鹽納米粒具有更高的飽和磁化強度［14］。筆者在前期的研究中，證實了MnFe2O4納米粒的穩定性、高敏感性及安全性，通過聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）和聚已內酯(Polycaprolactone,PCL)兩親性嵌段聚合物包被、自組裝形成PEG-PCL-MnFe2O4納米膠束能再進一步提升納米粒的磁化率，體外細胞實驗證實了其連接靶向Endoglin 的多肽后形成的CL-PEG-MnFe2O4納米膠束能與腫瘤源性血管內皮細胞和淋巴管內皮細胞特異性結合［6-7］。本研究中，筆者通過球后靜脈注射的方式將CL-PEG-MnFe2O4納米膠束引入到裸鼠乳腺癌移植瘤模型，MRI 及病理結果證實了PEG-PCL-MnFe2O4納米膠束在結合了靶向Endoglin的短肽后能與腫瘤血管及淋巴管結合。

圖2 靜脈注射PEG-PCL-MnFe2O4和CL-PEG-MnFe2O4后乳腺癌移植瘤的MR信號變化規律Fig.2 Changes in magnetic resonance signals of breast cancer xenografts after the intravenous administration of PEG-PCL-MnFe2O4 and CL-PEGMnFe2O4

表1 注射兩種對比劑后腫瘤實質的T2值及R2值（±s）Tab.1 T2 and R2 values of tumor parenchyma after the intravenous administration of PEG-PCL-MnFe2O4 and CL-PEG-MnFe2O4(Mean±SD)

表1 注射兩種對比劑后腫瘤實質的T2值及R2值（±s）Tab.1 T2 and R2 values of tumor parenchyma after the intravenous administration of PEG-PCL-MnFe2O4 and CL-PEG-MnFe2O4(Mean±SD)

*差異有統計學意義

掃描時間注射前0 min 5 min 15 min 30 min 60 min 2 h CL-PEG-MnFe2O4 T2值/ms 77.98±10.29 44.66±5.25 50.80±3.85 54.25±5.08 57.20±4.04 59.20±7.11*60.15±7.43*R2值/Hz 13.04±1.47 23.83±2.66 19.83±1.62 18.59±1.76 17.56±1.27 17.11±2.07*16.85±2.11*PEG-PCL-MnFe2O4 T2值/ms 78.66±5.71 44.85±5.67 50.06±8.62 63.10±8.36 70.19±7.71 74.76±10.60*76.63±12.13*R2值/Hz 12.76±0.98 24.39±5.98 20.55±3.32 16.15±2.14 14.36±1.49 13.61±1.75*13.33±1.89*

盡管通過包被、修飾以后納米粒具備了良好的水溶性及生物相容性，鏈接靶向介質后能與血管內皮主動結合，但由于要事先穿過血管壁、組織間隙和淋巴管壁，因而通過靜脈的途徑引入納米粒實現活體淋巴管顯像仍然面臨諸多困難［15］。研究表明：正常毛細血管壁難以透過粒徑超過50 nm 的納米粒［16］。然而，由于腫瘤新生血管內皮細胞增殖速度快，細胞不成熟，基底膜不完整，細胞間間隙大(約280～380 nm)，周細胞和平滑肌細胞缺失，從而使新生血管壁的通透性明顯增大，增加了納米粒到達組織間隙的概率［17］。進入間質的納米粒均會被淋巴管重吸收，這是因為淋巴管通透性非常高，淋巴管內皮細胞間的間隙能達到500 nm，且新生淋巴管由于內皮不成熟，缺少緊密連接，無錨定纖維蛋白及周細胞環繞，通透性進一步增加，加上淋巴管特有的虹吸功能，能將進入間質的納米粒吸收進淋巴管［18］。納米粒進入淋巴管后在特異性靶向介質的趨化下與淋巴管內皮細胞結合。

筆者前期的研究表明：納米粒在活體血漿內的清除時間大致為30 min，而靶向納米粒從血漿進入組織間隙，再由組織間隙內重吸收進入淋巴管的時間大致為60 min，這與文獻的報道相一致［14］。本研究中，由于考慮到實驗動物麻醉的效果及安全，筆者把最大觀察時間窗設定在120 min。結果顯示：無論是靶向組還是非靶向組，納米粒注射后信號迅速降低，代表著腫瘤組織的血流灌注，而周邊區信號改變強于中心區，這與腫瘤血管生成主要集中在腫瘤瘤周邊區有關。非靶向組的TIC 呈下降-上升型，且增強持續時間短，在納米粒注射后15 min 內信號就急劇回升，后回升減慢，在30 min 左右回到基線水平，呈指數樣衰減，這與納米粒在血漿中的廓清規律一致［19-20］。而靶向組納米粒注射后信號不能迅速回升，在60 min 后信號仍維持在一定水平，TIC 呈下降-上升-平臺型，這可能源于納米粒與血管內皮及淋巴管內皮的結合，術后標本的病理及免疫組化染色也印證了納米粒的存在。

在本研究中，盡管筆者證實了靶向Endoglin 的CL-PEG-MnFe2O4膠束能在活體顯示腫瘤新生血管及新生淋巴管，但仍然有以下幾點問題尚需進一步研究和完善。首先，經管短肽與納米膠束的結合在體外證實是穩定的，且短肽的活性也得以足夠的保留，但活體內復雜的生理、生化環境，尤其納米粒在穿過這么多障礙的過程中是否會破壞靶向納米粒的穩定性和靶向介質的活性尚不完全清楚，影像及病理結果可能會出現假陽性。其次，本研究中，由于病理及免疫組化的局限性，筆者仍然難以準確的區分顯像的新生血管、新生淋巴管以及正常微淋巴管。然而，免疫組化確實證實局部新生血管及新生淋巴管豐富，結合筆者前期體外實驗，筆者有理由相信基于CL-PEG-MnFe2O4膠束實現腫瘤新生血管及淋巴管的顯像可能性，為腫瘤新生血管和新生淋巴管的活體MR靶向顯像提供了實驗基礎。