酶解法制備玉米蛋白抗氧化肽的工藝研究

姬晨曦，杜晶芳，王詩馨，安 南，趙穎清，于亞莉

（吉林大學食品科學與工程系，吉林長春 130062）

我國已有470多年的玉米栽培歷史，除了小麥和水稻，玉米在糧食作物中居于第3位，目前我國的玉米種植量僅次于美國。玉米中所含營養素較為全面，玉米蛋白的制備和應用獲得了廣泛良好的來源。玉米蛋白粉是玉米淀粉在濕法加工中的副產物，其蛋白質含量達到50%以上，由于水溶性差、氨基酸不平衡，口感粗糙，所以在食品工業中的應用受到很大地限制[1-3]。故而絕大部分玉米蛋白并未物盡其用，造成了較大的浪費。玉米抗氧化肽的開發為玉米蛋白粉的深加工提供了契機。隨著保健食品市場的擴展，開發玉米新型功能肽對于提高人類健康水平和促進食品工業發展具有重要的經濟和社會意義。

近年來，玉米淀粉加工副產物已得到學術界的認可，逐漸將這些副產物進行綜合利用，開發其潛在價值。已有人將玉米漿回收以制取抗生素、酶制劑、味精、蛋白飼料粉，做成發酵工業培養基，并提取菲酊，制備植酸和肌醇[4-6]；而玉米胚芽則成為磷脂的良好提取源，胚芽蛋白精制后用作餅干點心的蛋白添加劑等[7]；玉米蛋白粉則已用于提取玉米黃素，制備谷氨酸、生產醇溶蛋白等。玉米蛋白特殊的氨基酸組成和序列使其肽鏈中存在著不同的功能區，具有抗氧化等多肽功能[3，8-9]。利用玉米蛋白此特點已制備出具有各種生物功能的活性肽[3，10-11]。但針對于該研究還是相對較少，因而，玉米功能活性肽的研究與開發成為科研熱點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米蛋白粉，陜西森弗天然制品有限公司提供。

1.2 試劑

堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；胰蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司提供；PBS，上海立菲生物技術有限公司提供；ABTS，NaOH，HCl和過硫酸鉀等，以上均為分析純。

1.3 儀器與設備

XMTD-8222型水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司產品；JJ-1型精密定時電動攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司產品；Starter2C型pH計，奧豪斯儀器（上海） 有限公司產品；ME203E型電子天平，METTLERTOLTDO產品；CR20B2型高速冷凍離心機，日立公司產品；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞破碎儀，新芝公司產品；SynergyHT型酶標儀，BioTek公司產品；DG-800型漩渦混合器，北京鼎國昌盛生物技術有限公司產品；MH-2型微量振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 玉米蛋白肽的制備

玉米蛋白粉過80目篩→配制質量分數為8%的玉米蛋白粉溶液→攪拌均勻→超聲功率500 W，時間10 min→在90℃下變性10 min→冷卻至適宜溫度→1 mol/L NaOH或HCl溶液調pH值至合適→同時加入10%堿性蛋白酶和定量胰蛋白酶→酶解→90℃下滅酶10 min→以轉速8 000 r/min離心10 min。

1.4.2 蛋白質水解度的測定

pH-stat法[12]（當蛋白質酶解過程中在pH值＞6.5時）。

式中：DH——蛋白質水解度，%；

V——水解過程中用去NaOH的量，mL；

M——蛋白粉質量，g；

η——蛋白粉中蛋白質含量，%；

C——NaOH標準溶液的濃度，mol/L；

1.01 ——氨基酸的平均解離度，%；

8.38 ——每克蛋白質中肽鍵的克當量，mol/L。

1.4.3 玉米蛋白肽抗氧化活性的影響

ABTS·清除率測定方法[13]。用蒸餾水配制7 mmol/L的ABTS溶液，將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液（終濃度為2.45 mmol/L）按1∶1的體積比混合，配制得到ABTS儲備液，并在室溫條件下避光靜置12～16 h后，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.4）將儲備液稀釋一定倍數（20～30倍），使其在波長734 nm處吸光度為0.7±0.02，形成ABTS工作液。用移液槍吸取180 μL的ABTS工作液至96孔板各孔中，然后每孔加入20 μL樣品溶液，振蕩10 s后，測定反應體系于波長734 nm處的吸光度。ABTS工作液現用現配。

試驗分為3組：①空白組：每孔加200 μL PBS溶液；②對照組：180 μL ABTS工作液加20 μL PBS溶液；③試驗組：180 μL ABTS工作液加20 μL樣品溶液（稀釋20倍）。每個樣品濃度設置6個復孔，取平均值。ABTS+·清除率計算公式如下：

式中：X——ABTS自由基清除率，%；

As——試驗組；

AC——對照組；

AB——空白組。

1.4.4 玉米蛋白酶解條件的確定

（1） 單因素試驗。控制酶解酶底比（4%，6%，8%，10%，12%）、酶解pH值（7，8，9，10，11，12）、酶解溫度 （45，50，55，60，65 ℃）、酶解時間（1，2，3，4，5 h） 其中的3個因素為定量，研究其中一個因素對制備玉米蛋白抗氧化肽的影響。

（2）正交試驗設計。在此前單因素試驗的基礎上，以ABTS·清除率和玉米蛋白水解度為評價指標。確定正交試驗的4個因素及3個水平進一步優化玉米蛋白酶解的工藝條件。

2 結果與分析

2.1 酶水解條件單因素試驗

2.1.1 [E]/[S]對玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]依次為4%，6%，8%，10%，12%時，酶解溫度55℃，pH值9.0，酶解4h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標，玉米蛋白水解度為輔助性指標，分別測得二者隨[E]/[S]變化的趨勢。

[E]/[S]與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系見圖1。

圖1 [E]/[S]與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系

從圖1可以看出，隨著[E]/[S]的變化，玉米蛋白的水解度在胰蛋白酶質量分數4%～8%時，水解度變化明顯，呈直線型，與水解速率基本成正比變化；而達到10%時水解速率明顯下降；當達到12%時，水解度雖然有所增加，但是變化趨勢已經趨于平緩。究其原因可能是底物質量分數和數量有限，從而限制了堿性蛋白酶和胰蛋白酶與底物的結合，導致水解度不會無限升高，后期變化趨勢不明顯并趨于平緩。

在[E]/[S]逐漸增加的情況下，制備所得玉米蛋白抗氧化肽活性逐漸上升，當[E]/[S]達到8%時，其抗氧化活性最大；當[E]/[S]＞8%時，玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除活性反而下降。當胰蛋白酶添加少量或者適量時，玉米蛋白底物能夠與酶充分結合，水解產生的活性短肽逐漸增加，以至于粗提液的抗氧化活性增強；但蛋白酶添加過量時，會使已產生的多肽過度水解，得到分子量更小的肽段或游離氨基酸，導致具有較高自由基清除能力的多肽含量降低，使自由基清除能力降低[14]。

2.1.2 pH值對玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，酶解溫度55℃，酶解時間4 h，pH值依次變化時，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標，玉米蛋白水解度為輔助性指標，二者的變化情況。

pH值與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系見圖2。

圖2 pH值與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系

從圖2可以看出，隨著pH值的增加，玉米蛋白水解度處于上升趨勢，在pH值為11時，水解度達到最大，pH值再次增加時，水解度漸次下降。水解度與蛋白酶的最適pH值息息相關。試驗中使用了堿性蛋白酶和胰蛋白酶2種酶進行水解。而試驗用堿性蛋白酶的最佳pH值處于9～12，胰蛋白酶則位于8～10。只有pH值處于合適的范圍內，蛋白酶才能最大程度的發揮作用。前期當pH值處于7～10時，發揮水解作用的主要是胰蛋白酶，堿性蛋白酶效力較弱；當pH＞10時，堿性蛋白酶成為主要發揮作用的酶，而胰蛋白酶則由于所處環境過堿性，所以活力減弱，或許正是兩者強弱配合使得玉米蛋白水解度在pH值為11時達到最大；當pH＞11時，pH值環境已然超過堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最適范圍，引起酶分子內部構象的改變即蛋白酶的部分變性，使得酶與底物不能有效結合，進一步導致水解度降低。而玉米蛋白水解液的抗氧化活性最初隨著pH值的上升而增強，當pH值9.0時，玉米蛋白水解液的抗氧化活性達到最高；而pH＞9.0后，水解液的ABTS自由基清除活性急速下降。抗氧化活性的降低可能是由兩部分原因引起：過堿的環境致使酶結構被破壞，堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解玉米蛋白產生的抗氧化活性肽濃度較低；另一方面，雖然過堿環境破壞了部分酶結構，足夠的時間內玉米蛋白仍然水解完全，但是強堿性環境對產生的玉米蛋白抗氧化肽的理化結構造成損傷，使其抗氧化活性降低，從而造成水解液抗氧化活性降低。

2.1.3 酶解溫度對玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，pH值9.0，酶解時間4 h后，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要衡量指標，玉米蛋白水解度為輔助性指標，二者隨酶解溫度變化的情況。

酶解溫度與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系見圖3。

圖3 酶解溫度與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系

從圖3可以看出，玉米蛋白水解度隨著酶解溫度上升而上升；當酶解溫度達到55℃時，水解度最大；此后溫度繼續上升時，水解度則有較大幅度的下降。堿性蛋白酶和胰蛋白酶最適作用溫度分別為55～70℃和40～60℃。酶解溫度低于55℃時，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的作用環境并未達到最適，相同水解時間內，玉米蛋白水解程度并不完全；而當酶解溫度高于55℃時，胰蛋白酶結構已經不再穩定，酶活性降低，玉米蛋白水解度降低。

玉米蛋白抗氧化肽的抗氧化活性開始時隨著酶解溫度升高而升高，當酶解溫度達到55℃時，水解液的抗氧化活性最高，酶解溫度高于55℃時，水解液的抗氧化活性漸漸下降。酶解溫度過高時，酶結構發生改變，酶活性降低，對玉米蛋白抗氧化肽的產生有不良影響。另一可能情況則是酶解溫度過高時，蛋白酶活性降低，雖然產生了足夠數量的玉米蛋白抗氧化肽，但高溫使得玉米蛋白抗氧化肽的結構改變，ABTS·清除活性降低。

2.1.4 酶解時間對玉米蛋白水解度和水解液抗氧化活性的影響

胰蛋白酶[E]/[S]為8%，酶解溫度55℃，pH值9.0，以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS自由基清除率為主要衡量指標，玉米蛋白水解度為輔助性指標，二者隨酶解時間的變化。

酶解時間與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系見圖4。

圖4 酶解時間與玉米抗氧化肽水解度和自由基清除率的關系

從圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，玉米蛋白水解度漸次上升，酶解時間達到4 h時，水解度達到最大，時間繼續延長并不能使水解度繼續上升，并且在誤差范圍內略有下降。隨著酶解時間的延長，玉米蛋白分子結構較大程度改變，酶切位點暴露全面，水解度上升，但玉米蛋白底物含量有限，經過4 h后，酶解完全，時間繼續延長并不能使水解度繼續增加，因此保持平緩狀態。

隨著酶解時間的延長，ABTS·清除率顯著增加。酶解時間為2 h時，ABTS·清除率最高，時間繼續延長反而使得ABTS·清除率下降。出現這樣的反應趨勢是由于反應時間過長，堿性蛋白酶和胰蛋白酶促使玉米蛋白過度水解，產生分子量更小的肽甚至是游離氨基酸，使得具有自由基清除能力的多肽被破壞，影響了玉米蛋白抗氧化肽的活性[15]。另一方面可能是由于酶解時間過長，玉米蛋白酶解產生的有效抗氧化活性肽過度酶解，導致其ABTS·清除活性下降。

2.2 正交試驗結果

在此前單因素試驗的基礎上，以ABTS·清除率為主要評價指標。通過正交試驗進一步優化玉米蛋白酶解的工藝條件。

L9（34）正交試驗因素與水平設計見表1，正交試驗結果分析見表2。

從表2可以看出，方案設計中影響玉米蛋白水解度的主次順序為D＞C＞B=A。極差分析顯示，pH值是影響玉米蛋白水解度的關鍵因素。水解度優化的綜合選擇為A2B1C3D3，即[E]/[S]為8%，酶解時間2 h，酶解溫度60℃，pH值9.0。酶解條件按此組合可獲得玉米蛋白的最大水解度。根據表2～表5的方差分析發現pH值對水解度的影響極為顯著，溫度影響次之。

表1 L9（34）正交試驗因素與水平設計

表2 正交試驗結果分析

對抗氧化活性而言，胰蛋白酶[E]/[S]、酶解溫度、pH值和酶解時間4個因素中影響玉米蛋白抗氧化肽清除ABTS·的主次順序為C＞D＞B＞A。從極差分析中可以看出溫度是酶解過程中影響玉米蛋白抗氧化肽ABTS·清除率的最主要因素，pH值次之，[E]/[S]的影響最小。各方面綜合考慮，最終優選制備玉米蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件為A1B1C3D3，即[E]/[S]6%，酶解時間2 h，酶解溫度60℃，pH值9.0。工藝條件如此組合時，玉米蛋白抗氧化肽可以獲得最高的ABTS·清除率。依據表4可得，酶解溫度和pH值對玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率影響十分顯著，時間影響相對較弱，[E]/[S]的影響則可以記為試驗的誤差列。

水解度的方差分析見表3，ABTS·清除率方差分析見表4。

綜合考慮玉米蛋白水解度和水解液的抗氧化活性，可能因為試驗過程中采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶共同控制水解，水解度和ABTS·清除率之間無必然的因果聯系。而試驗主要以玉米蛋白抗氧化肽的ABTS·清除率為主要指標，因此，采用A1B1C3D3組合作為最終的制備工藝條件，以期能夠同時獲得較好的水解度和良好的玉米蛋白抗氧化肽。

表3 水解度的方差分析

表4 ABTS·清除率方差分析

3 結論

以玉米蛋白水解度和水解液的ABTS·清除率為檢測指標，對堿性蛋白酶配合胰蛋白酶水解玉米蛋白的工藝條件進行了優化。在堿性蛋白酶用量固定的情況下，玉米蛋白水解的最適條件為酶解溫度60℃，pH值9.0，胰蛋白酶[E]/[S]6%，酶解時間2 h。經過驗證試驗證明，在此條件下，玉米蛋白水解度為20.42%，水解液ABTS·清除率為90.06%±0.7%。與單因素試驗和正交試驗各組試驗條件所得結果相比，經過正交試驗優化篩選的試驗條件能夠同時獲得令人滿意的水解度和ABTS自由基清除率，并且試驗結果更加穩定。