復方安神精油吸入給藥的鎮靜催眠作用及化學成分的GC-MS分析

鐘 鈺，鄭 琴*，胡鵬翼，黃小英，楊 明*，任桂林，張科楠，李 菁

1江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室 創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室，南昌 330004；2西南醫科大學附屬中醫醫院，瀘州 646000

失眠是睡眠中斷或睡眠時間減少所引起的一種睡眠障礙，主要表現為睡眠時間和睡眠深度的不足。據專家估計，到2020年全球大約有7億多失眠者。大量的失眠癥患者伴有不同程度抑郁、焦慮癥狀，導致患者精神活動效率下降，造成病人免疫功能下降、植物神經功能紊亂，增加糖尿病、冠心病、老年癡呆癥等的患病風險[1]。治療失眠比較常見的藥物主要包含苯二氮卓類、非苯二氮卓類、具有鎮靜作用的抗抑郁藥等幾種類型[2]，長時間使用易產生依賴性、耐受性、戒斷癥狀、反跳作用等各種不良反應。長期以來人們寄希望于通過天然植物來達到更安全、不良反應更小的治療目的，越來越多的學者熱衷于探求新的、安全的輔助或替代療法以治療失眠。研究發現，芳香植物精油通過吸嗅療法具有良好的鎮靜催眠作用，相比口服藥物安全性強，可避免日間宿醉、首過消除和對胃腸道刺激。沉香精油[3]、川芎精油[4]、佩蘭精油[5]吸入給藥均具有鎮靜催眠作用，可顯著減少動物自主活動，縮短睡眠潛伏期，延長睡眠時間。在復方精油的相關研究方面，一種用甜牛至精油、德國甘菊精油和薰衣草精油調配而成的復方精油[6]和以左旋芳樟醇為主要原料配制的復方精油[7]均具有安眠功效。

本實驗基于芳香療法理論為指導，研究一種以薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等多種具有鎮靜催眠、抗焦慮、抗抑郁的芳香植物精油配伍的復方安神精油吸入給藥的鎮靜催眠作用，采用GC-MS分析復方安神精油揮發性化學成分以及入腦的主要化學成分，基于網絡藥理學探討復方安神精油治療失眠癥的作用機制，旨在為復方安神精油通過芳香療法治療與改善失眠癥提供理論依據。

1 材料

1.1 試驗動物

6～8周齡ICR小鼠，雌雄各半，體重25～35 g，江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008。

1.2 主要藥品與試劑

復方安神精油，江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室提供，批號20180715，主要成分為薰衣草精油、甜橙精油、檀香精油等；地西泮片(北京益民藥業有限公司，批號H11020898)；戊巴比妥鈉(德國Merck公司，批號20171230)；生理鹽水注射液(江西科倫藥業有限公司，批號C18081701)；吐溫-80(上海三浦試劑公司，批號：20180323)；乙醇消毒液(南昌利康藥械實業有限公司，批號18041601)；氫氧化鈉(西隴化工股份有限公司，批號20180227)；三氯甲烷(西隴科學股份有限公司，批號20170705)；乙醚(國藥集團化學試劑有限公司，批號20180601)。

1.3 主要設備及儀器

超聲霧化香薰機(深圳市康美太實業有限公司)；動物香薰室(有機玻璃制成的50×50×40 cm大箱結構，其內部放置4個20×20×20 cm可通氣體的小箱結構，中間可放置超聲霧化香薰機)；SMART行為記錄視頻分析系統(Panlab公司)；Agilent 7890A氣相色譜-5975質譜聯用儀(美國安捷倫公司)。

1.4 網絡藥理學軟件與數據庫

TCMSP數據庫(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 、OMIM數據庫(http://www.omim.org/)、TTD 數據庫(https://db.idrblab.org/ttd/)、Drugbank數據庫(https:// www.drugbank.ca/)、Cytoscape 7.0 軟件。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

選用ICR小鼠，雌雄各半。實驗期間，動物可得到足夠的食物和水。實驗間飼養環境的溫度為21±1 ℃，濕度55%±5%，明暗交替12 h，自由飲水和進食，適應性喂養1周后開始實驗。實驗設空白組(正常喂養)，3個復方安神精油組(吸入給藥1天組、吸入給藥7天組及吸入給藥14天組)，3個陽性藥組(陽性藥給藥1天組，陽性藥給藥7天組及陽性藥給藥14天組)。復方安神精油各組小鼠每天吸入濃度為2×10-3的復方安神精油(預實驗測得的有效吸嗅濃度，復方安神精油用濃度為1%的吐溫-80溶液稀釋)，將超聲霧化香薰機置于動物香薰室中，使藥物充分揮發彌漫整個香薰室內，再將復方安神精油各組小鼠依次置入香薰室中，蓋上箱蓋，連續吸入給藥60 min，吸嗅時間段為每日8:00～16:00。地西泮用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的溶液，陽性藥各組灌胃地西泮溶液，給藥劑量為1 mg/kg(根據成人臨床劑量采用體表面積等效劑量比值換算成小鼠等效劑量)，空白組和復方安神精油各組灌胃等體積的蒸餾水。

2.2 小鼠自主活動測試

各組小鼠于末次給藥30 min后，對每組小鼠分別進行自主活動測試。小鼠適應環境5 min，計數3 min內小鼠移動的距離和站立次數等行為學參數，比較各組小鼠間的差異。自主活動測試指標：移動距離，單位：cm；最大速度，單位：cm/s；平均速度，單位：cm/s；靜止時間，單位：s；站立次數。

2.3 戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期與睡眠時間

自主活動測試完畢后，各組小鼠分別腹腔注射閾劑量45 mg/kg(預實驗測得引起100%小鼠睡眠的最小劑量)的戊巴比妥鈉，于給藥前用生理鹽水配制戊巴比妥鈉溶液。以給藥后小鼠翻正反射消失達1 min為入睡指標，注射藥物至翻正反射消失的時間為睡眠潛伏期，翻正反射消失至恢復所經歷的時間為睡眠時間，記錄小鼠睡眠潛伏期與睡眠時間。

2.4 統計學處理

2.5 復方安神精油的化學成分與入腦的化學成分分析

2.5.1 腦組織樣品的制備

選取10只SD大鼠，雌雄各半。大鼠每天鼻腔給藥20 μL的復方安神精油，連續鼻腔給藥7天，于第7天鼻腔給藥完畢30 min后處死，取出全腦，生理鹽水洗凈，再加入生理鹽水2 mL勻漿，離心，取上清液1 mL，加入2 mol/L NaOH 50 μL，三氯甲烷2 mL振搖，離心，取出三氯甲烷層，10只合并，揮干，加入乙醚2 mL，微孔濾膜過濾，即得[8]。

2.5.2 GC-MS色譜條件

氣相色譜條件：采用Agilent DB-624(30 m×320 μm×1.8 μm)毛細管色譜柱，載氣為高純He(99.999%)，進樣量為l μL，分流比40∶1，流速1 mL/min。升溫程序：初始溫度40 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升溫至220 ℃，再以25 ℃/min 升溫至280 ℃(保持9 min)。質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃；接口溫度250 ℃，溶劑延遲3.0 min，質量掃描模式全掃描，掃描范圍30～650 amu。標準譜庫 NIST11檢索，峰面積歸一法計算各組分相對百分含量。

2.6 基于網絡藥理學構建對復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖

利用TCMSP數據庫、Pubchem數據庫、OMIM數據庫篩選出治療失眠癥的活性成分，將治療失眠癥的活性成分與復方安神精油主要化學成分取交集，得到復方安神精油治療失眠癥相關活性成分。利用TTD數據庫、Drugbank數據篩選出治療失眠癥靶點以及復方安神精油活性成分靶點，將治療失眠癥靶點與復方安神精油活性成分靶點取交集,得到復方安神精油治療失眠癥相關作用靶點。將復方安神精油治療失眠癥相關活性成分和治療失眠癥相關作用靶點導入Cytoscape7.0軟件,構建復方安神精油活性成分-作用靶點網絡,預測和篩選出復方安神精油治療失眠癥關鍵性的作用靶點與活性成分。

3 結果與分析

3.1 小鼠自主活動測試實驗結果

小鼠自主活動測試實驗結果見表1。結果表明，與空白組比較，吸入給藥1天組顯示出鎮靜催眠作用，吸入給藥7天和吸入給藥14天組的鎮靜催眠作用極顯著，小鼠的自主活動量極顯著減少，表現為移動距離和站立次數極顯著減少(P<0.01)、平均速度與最大速度極顯著減小(P<0.01)、靜止時間極顯著增加(P<0.01)，陽性藥給藥1天組的鎮靜催眠作用極顯著(P<0.01)，隨著給藥時間的的延長，陽性藥給藥7天、陽性藥給藥14天組的小鼠自主活動量增加。

3.2 戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期與睡眠時間的實驗結果

戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期與睡眠時間實驗結果見表2。結果表明，在睡眠潛伏期方面，與空白組相比，陽性藥給藥1天組的睡眠潛伏期極顯著減少(P<0.01)，其次是吸入給藥7天(P<0.01)、吸入給藥14天組(P<0.01)，隨著給藥時間的延長，陽性藥給藥14天組的睡眠潛伏期有增加的的趨勢；在睡眠時間方面，與空白組相比，陽性藥給藥1天組的睡眠時間極顯著增加(P<0.01)，其次是吸入給藥7天組(P<0.01)、吸入給藥14天組(P<0.01)，隨著給藥時間的延長，陽性藥給藥14天組的睡眠時間有減少的趨勢。

表1 復方安神精油對小鼠移動距離、平均速度、最大速度、靜止時間、站立次數的影響

注：其他各組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

表2 復方安神精油對戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠潛伏期和睡眠時間的影響

注：其他各組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.3 復方安神精油的化學成分與入腦化學成分分析結果

復方安神精油的主要化學成分見表3，GC-MS分析復方安神精油成分TIC圖見圖1。鑒定出30個復方安神精油的化學成分，占揮發油總量的93.39%。復方安神精油主要成分為酯類、醇類、烯烴類、烷烴類等化合物，其中含量最高的是D-檸檬烯(24.07%)，其次是芳樟醇(21.98%)、乙酸芳樟酯(15.37%)，α-蒎烯(5.39%)，α-檀香醇(4.8%)等。復方安神精油入腦主要化學成分見表4，GC-MS分析復方安神精油入腦成分TIC圖見圖2。通過計算機自動檢索標準譜庫 NIST11，并與復方安神精油成分TIC圖以及復方安神精油的主要化學成分進行比較，分析與鑒定出6個復方安神精油入腦的化學成分，分別是D-檸檬烯(D-Limonene),芳樟醇(Linalool),乙酸芳樟酯(Linalyl acetate),α-檀香醇(α-Santalol)，十九烷(Nonadecane)、二十烷(Eicosane)。

3.4 復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖構建與分析

基于復方安神精油化學成分的GC-MS分析結果，由數據庫篩選得到復方安神精油治療失眠癥相關作用靶點見表5，復方安神精油治療失眠癥相關活性成分見表6，構建復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖見圖3，圖中共有64個節點，每條邊代表活性成分與靶點間的相互作用。其中紅色節點代表復方安神精油治療失眠癥相關的39個作用靶點，形狀越大代表其關聯的活性成分越多；綠色節點代表復方安神精油中25個治療失眠癥相關的活性成分；形狀越大代表其關聯的作用靶點越多。具有很高的Degree的節點為“中樞節點”，在整個復方安神精油活性成分-作用靶點網絡中占據重要地位[9]。因此在復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖中預測NR1I2(孕烷X受體)、ESR1(雌激素受體)、NR1I3(組成性雄甾烷受體)、GABRA1(γ-氨基丁酸受體α1)、CYP19A1(細胞色素P450)、NR1H4(膽汁酸受體)靶蛋白與復方安神精油發揮鎮靜催眠作用密切相關。此外，預測和篩選Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在復方安神精油治療失眠癥過程中發揮關鍵性作用。

圖1 GC-MS分析復方安神精油成分TIC圖Fig.1 GC-MS analysis of composite compound anshen essential oil TIC diagram

圖2 GC-MS分析復方安神精油入腦成分TIC圖Fig.2 GC-MS analysis of compound anshen essential oil into brain component TIC diagram

表3 復方安神精油主要化學成分

表4 復方安神精油入腦化學成分

圖3 復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖Fig.3 Component-target network of compound anshen essential oil

4 結論

芳香吸入療法中精油的芳香物質經鼻腔吸入后作用于嗅腦，促進神經物質的釋放進而調控植物神經系統，調動體內積極因素并釋放各種情感信息，從而達到治療、防治疾病的目的[10]。由于鼻腔與腦組織之間存在著直接的解剖學通道，藥物可通過鼻粘膜吸收，繞過血腦屏障直接轉運入嗅球或腦脊液進而直接進入腦組織[11]。“吸嗅入腦”是一種無損性給藥方式，最大限度地減少毒副作用，因此可能成為有效控制和治療失眠等精神類疾病的給藥途徑。動物自主活動測試實驗和閾劑量戊巴比妥鈉誘導的睡眠潛伏期與睡眠實驗是治療失眠癥藥物藥效的常見評價方法。研究結果表明，復方安神精油具有鎮靜催眠作用，可顯著減少動物自主活動，縮短睡眠潛伏期、延長睡眠時間，隨著吸入給藥時間的增加未表現出顯著的藥物耐受性。

表5 復方安神精油治療失眠癥相關作用靶點

表6 復方安神精油治療失眠癥相關活性成分

通過GC-MS追蹤復方安神精油的揮發性化學成分，其中D-檸檬烯[12]、芳樟醇[13]、乙酸芳樟酯[14]、α-檀香醇[15]均已有報道證明具有中樞神經鎮靜作用；此外，D-檸檬烯具有抗焦慮、舒緩情緒的作用[16]，芳樟醇具有緩解抑郁樣作用[17]，α-蒎烯具有抑制焦慮情緒[18]、緩解壓力[19]等作用，推測復方安神精油的鎮靜催眠功效與其主要化學成分及活性相關。GC-MS分析復方安神精油入腦主要化學成分為D-檸檬烯,芳樟醇,乙酸芳樟酯,α-檀香醇，十九烷，二十烷。

基于網絡藥理學構建的復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖可以看出，在GC-MS追蹤的30個復方安神精油的揮發性化學成分中，篩選出25個治療失眠癥相關活性成分作用于39個治療失眠癥相關作用靶點，其中作用靶點包括5-羥色胺受體、γ-氨基丁酸受體、腎上腺素受體、去甲腎上腺素受體、多巴胺受體、乙酰膽堿受體、食欲素受體以及膽汁酸受體等。因此復方安神精油治療失眠癥是通過多個成分作用于多個靶點產生效應，體現了復方安神精油多成分、多靶點的作用特點。預測復方安神精油主要通過NR1I2、ESR1、NR1I3、GABRA1、CYP19A1、NR1H4相關靶蛋白發揮藥效作用，篩選出Dibutyl phthalate、Caryophyllene、Geranyl acetate、Linalool、α-Terpineol、Terpinen-4-ol在復方安神精油治療失眠癥過程中發揮關鍵性的作用。GC-MS追蹤的30個復方安神精油的主要揮發性化學成分中含量最高的化學成分以及入腦的主要化學成分D-limonene、linalool、linalyl acetate、α-pinene、α-santalol、nonadecane具有治療失眠癥相關性并在復方安神精油活性成分-作用靶點網絡圖同樣占據重要的地位。對網絡藥理學預測的關鍵靶點進行相關研究文獻驗證，孕烷X受體作為關鍵的轉錄調控因子參與多種藥物代謝酶和轉運蛋白的誘導表達，在機體異源性和內源性物質的代謝及排泄過程中起重要的調控作用，參與機體脂質、膽固醇和糖代謝從而維持機體內環境的穩態[20]。雌激素受體存在于腦的許多部位，廣泛表達于與情感刺激加工有關的腦區域，如海馬、杏仁核、下丘腦、額皮質和脊核，能影響人類各種認知、情感及行為，調節5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和單胺氧化酶，對中樞神經系統發揮重要的調控作用[21]。組成性雄甾烷受體經配體激活后可調控藥物代謝酶及轉運體的表達和活性，調節毒性物質的清除、解毒及代謝過程，保護機體免受外源性化學物質和內源性毒性脂質損傷，并參與糖、脂代謝和炎癥等信號通路的調控[22]。γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳動物中樞神經系統的抑制性神經遞質，γ-氨基丁酸(GABA)與失眠機制的發生及進展聯系密切，其主要作用的受體為γ-氨基丁酸α型受體[23]。細胞色素P450主要分布在內質網和線粒體內膜上，參與生物體內的甾醇類激素合成等過程[24]，參與藥物代謝并對細胞因子和體溫調節具有重要作用。膽汁酸受體作為一種膽汁酸激活的核受體，參與機體多種生理活動的調節，包括膽汁酸代謝、脂代謝、糖代謝、肝臟保護等過程[25]，與抗膽堿能、鎮靜催眠等作用密切相關。基于網絡藥理學方法預測和篩選的復方安神精油活性成分均具有一定的鎮靜催眠作用相關性，其活性成分與作用靶點之間的關聯性，在一定程度上證實復方安神精油鎮靜催眠作用研究以及復方安神精油主要化學成分與入腦的主要化學成分的GC-MS分析結果的可靠性。

研究表明，復方安神精油具有鎮靜催眠功效；復方安神精油的主要化學成分與入腦的主要化學成分中含有多種具有神經中樞鎮靜催眠作用以及抗焦慮、抗抑郁作用的揮發性化學成分；基于網絡藥理學預測和篩選出25個治療失眠癥相關活性成分作用于39個治療失眠癥相關作用靶點，體現復方安神精油多成分、多靶點的鎮靜催眠作用特點，上述結果與文獻報道基本一致。本研究為基于芳香療法理論指導下的復方安神精油發揮其鎮靜催眠功效與進一步深入闡明復方安神精油治療失眠癥的作用機制提供科學依據，并為探索治療失眠癥安全的輔助與替代療法提供新途徑。