竹葉花椒枝和葉精油化學成分及其對二磷酸腺苷誘導血小板聚集的影響研究

馬 捷，李 梅*，寧莉萍*，王景燕,3，龔 偉,3，高 玥，丁 文，唐 詩

1四川農業大學林學院，成都611130；2四川旅游學院，成都610100；3四川農業大學生態林業工程省級重點實驗室，成都611130

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)為蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum小喬木，耐寒，耐旱，不耐澇，適生于肥沃壤土和沙壤土。竹葉花椒果皮辛香，是東亞地區的傳統烹飪調料和中藥材原料。據《中華人民共和國藥典》記載，其果皮及種子可溫中止痛，殺蟲止癢。因此，目前國內外學者的研究主要集中于花椒果皮的化學成分、提取工藝[1]、生物活性[2]、貯藏條件[3]、豐產栽培[4]等方面，鮮見枝葉研究。而在生產實踐中，枝葉量大但不好回收利用。利用植物對環境脅迫的響應原理以及竹葉花椒優良的萌蘗能力，低海拔種植地區直接從二級分支處剪截大枝再采果，廢棄枝葉占竹葉花椒當年營養生長物質總量的80%以上，如何進行整株綜合利用有待研究。

精油為植物次生代謝產物，是具有一定氣味的揮發性油狀液體物質，在日用化工、醫療保健、害蟲防治、食品工業等領域均有著廣泛的用途[5]。花椒果精油具有抗菌[6]和抗氧化[7]特性，長期食用可緩解冠狀動脈粥樣硬化性心臟病[8]，但竹葉花椒枝和葉精油卻未有相關報道。因此，本研究以竹葉花椒枝和葉為研究對象，通過水蒸氣蒸餾法提取精油[9]，分析其化學成分和研究其抗二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，ADP)誘導的家兔血小板聚集活性[10]，以期為高效合理和高值化利用竹葉花椒廢棄物資源提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

竹葉花椒枝和葉采自四川省崇州市四川農業大學教學實踐基地，八月份采集。日本大耳白兔購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。主要試劑有ADP和二甲基亞砜(DMSO)，Sigma公司；替卡格雷(Ticagrelor)，上海冠東生物科技有限公司。主要儀器有B24-29型揮發油測定儀，東莞市創瑞工業試驗設備有限公司；Agilent-HPGC7890型氣相色譜儀，Agilent公司；MDSMS5975型質譜儀，Agilent公司；Chrono-log700型血小板聚集儀，Chrono-log公司。

1.2 精油提取

參考文獻方法[9]，準確稱取竹葉花椒新鮮枝600 g、葉600 g，粉碎處理。根據《中華人民共和國藥典》揮發油測定法(甲法)，將粉料放入圓底燒瓶中，按固液比約1∶4加入蒸餾水，浸泡2小時后緩慢加熱至沸騰，保持微沸5小時后停止加熱，待裝置冷卻至室溫，收集回流冷凝裝置中的精油，用無水硫酸鈉干燥后避光保存于4 ℃環境中。

1.3 Gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)檢測

正己烷以100∶1稀釋樣品。氣相色譜條件：色譜柱HP-VOC 30 m×0.25 mm×0.25 μm。升溫程序：初始溫度40 ℃保持2 min，再以5 °C/min升至180 ℃保持2 min，后以5 °C/min升至240 ℃保持8 min；進樣口溫度250 ℃，進樣量10 μL，載氣為高純度氦，流速1.0 mL/min。質譜條件：電離方式EI，電離能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35～550m/z。數據處理與質譜檢索：通過對總離子流各質譜掃描后得質譜圖，經軟件檢索NIST14.L譜庫，結合比對保留時間及保留指數，查閱相關文獻，最終確定精油化學組成，用峰面積歸一法測算各成分的相對含量。

1.4 抗ADP誘導的家兔血小板聚集活性檢測

參考文獻方法[10]，精油樣品加DMSO稀釋，配制成100 mg/mL溶液備用。陽性對照Ticagrelor加 DMSO溶解，制成0.5 mg/mL溶液備用。日本大耳白兔經耳中央動脈抽取血液(枸櫞酸鈉真空抗凝采血管，全血∶枸櫞酸鈉為9∶1)，所得抗凝血離心(200×g,10 min)所得上清液為富血小板血漿(Platelet rich plasma,PRP)；剩余血液繼續離心(2 400×g,20 min)，所得上清液為貧血小板血漿(Platelet poor plasma,PPP)，以PPP調PRP血小板計數為500×109個/L。

抑制率(%)=(空白對照組最大聚集率-樣品

組或陽性對照組最大聚集率)/空白對照組最大聚

集率× 100%

2 結果與討論

2.1 精油提取量

竹葉花椒葉精油提取量為0.67 mL/kg，枝精油提取量為0.22 mL/kg，葉精油提取量是枝精油的3.05倍，葉精油提取量明顯高于枝精油。目前國內外對竹葉花椒葉和枝精油的研究僅集中于精油成分及生物活性方面，其提取量還未有相關報道，因此本研究是首次報道竹葉花椒枝和葉精油的提取量。

2.2 精油的GC-MS分析

圖1、圖2分別為竹葉花椒枝和葉精油總離子流圖。表1為竹葉花椒枝和葉精油主要化學成分。本文采用峰面積歸一法計算化合物在精油中的相對含量，每個峰代表一個化合物，由圖1、圖2和表1比較可知，葉精油中芳樟醇的相對含量即占62.01%，所以峰明顯，其他成分相對含量較低，因此與芳樟醇比峰不明顯。枝精油多峰明顯突出，是因為主要成分分布較分散。葉精油主要集中于10到30分鐘區間出峰，而枝精油在30分鐘到45分鐘出峰密集，說明枝精油較葉精油含有更多熔沸點較高、分子量較大、分子結構更復雜的化合物。

圖1 竹葉花椒枝精油總離子圖Fig.1 The total ion chromatogram of essential oilsfrom branches of Zanthoxylum armatum DC.

圖2 竹葉花椒葉精油總離子圖Fig.2 The total ion chromatogram of essential oils from leaves of Zanthoxylum armatum DC.

枝精油鑒定出48種化學成分，占化合物總量的96.59%；葉精油鑒定出45種，占化合物總量的99.92%。枝精油主要化學成分有2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亞麻醇5.32%，芳樟醇5.21%。葉精油主要化學成分有芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-檸檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-對孟二烯2.27%。二者共同共有16種化學成分，分別占竹葉花椒枝精油和葉精油總含量的52.51%和87.6%。目前關于竹葉花椒葉精油成分的報道均來自印度學者。印度竹葉花椒葉精油主要成分為2-十一酮44.58%，芳樟醇14.53%，2-十三酮7.98%[11]。與本研究測得的中國竹葉花椒葉精油主要成分相似，都含有芳樟醇，2-十一酮，2-十三酮且含量明顯高于其他化合物。但它們各自在總量中的相對含量具有較大差異，應該是受到了不同地理環境、氣候和生境的影響。云南西雙版納產竹葉花椒枝精油主要成分為茴香烯20.5%，1,8-桉葉素14%，2-十三酮12.5%[12]，盡管與本研究中枝主要成分有一定差異，但都含有2-十三酮。竹葉花椒果精油主要成分為芳樟醇56.77%，D-檸檬烯18.97%，β-水芹烯11.98%[13]，其與竹葉花椒葉精油的主要成分相似度較枝精油高，這與葉的光合作用最為活躍，其次生代謝產生的大量化合物就近運輸至果實有關。

竹葉花椒枝和葉精油開發前景十分廣闊。竹葉花椒葉精油對大鼠爪水腫情況有顯著的鎮痛和抗炎作用[11]，可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鼠傷寒沙門氏菌、糞腸球菌的細胞活性[14]。其中主要化合物芳樟醇有鎮痛、抗焦慮、鎮靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性[15]；β-石竹烯有抗炎、抗癌、鎮痛、神經保護和防治肝損傷等作用[16]；D-檸檬烯可防治糖脂代謝紊亂、抗炎、抑菌、抗癌[17]。此外，芳樟醇有鈴蘭香，β-石竹烯有柑橘香，D-檸檬烯有檸檬香，2-十三酮有奶香和藥草樣，2-十一酮有玫瑰香、奶酪香以及椰香，均為生產中常用的食用香精和香料。因此竹葉花椒枝和葉可作為開發優質香料、食用香精及醫藥保健品的原料選擇。在預防心腦血管疾病方面，芹菜籽油能顯著抑制ADP誘導的兔血小板聚集[18]，而芹菜籽油中的典型活性成分D-檸檬烯、芳樟醇、β-石竹烯竹[19]與竹葉花枝和葉精油相同，因此下文將對竹葉花椒枝和葉精油對ADP誘導的兔血小板聚集的影響進行研究，以期為竹葉花椒枝和葉的高值化利用提供參考。

2.3 抗ADP誘導的家兔血小板聚集活性測定

城市化生活導致高脂血癥、動脈粥樣硬化、高血壓等心腦血管疾病患者驟增的同時，亦使這一群體對此類醫療保健的需求上漲。由于治療心腦血管疾病的藥物普遍價格較高，多數非洲和亞洲發展中國家的慢性病患者正轉向國家衛生部推薦的植物類藥物作為替代治療來源。已有研究表明花椒果精油可減輕冠狀動脈狹窄程度，為心腦血管疾病患病的保護因素[8]。竹葉花椒果精油主要成分為芳樟醇，D-檸檬烯，β-水芹烯，β-石竹烯，而竹葉花椒枝和葉精油均含有大量的芳樟醇、D-檸檬和β-石竹烯。相似的成分可能導致相似的生物活性。竹葉花椒枝和葉作為廢棄物，量大且幾乎零成本，目前采用的焚燒還田的做法不僅浪費碳匯資源而且污染環境。如果能從竹葉花椒枝和葉中提取出對心腦血管疾病具有療效的成分，不僅可以高效利用廢棄資源，而且有可能顯著降低此類藥物的成本。

表1 竹葉花椒枝和葉精油主要化學成分

續表2(Continued Tab.2)

峰號No.保留時間tR(min)化合物Compound含量Content(%)枝Branch葉Leaf3925.882-十七醇2-Heptadecanol0.504026.88欖香素Elemicin0.124127.23橙花叔醇2 Nerolidol 20.290.934227.72桉油烯醇Spathulenol0.200.144327.86氧化石竹烯Caryophyllene oxide1.930.364428.5(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-四甲基-12-氧雜環[9.1.0]十二烷-3,7-二烯(1R,3E,7E,11R)-1,5,5,8-Tetramethyl-12-oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7-diene0.534528.67癸氫-3,3,4,7a-四甲基-1H-環戊烷[a]戊-7-醇乙酸酯Decahydro-3,3,4,7a-tetramethyl-1H-cyclopenta[a]pentalen-7-ol acetate0.144629.52α-畢橙茄醇α-Cadinol0.504729.52綠花白千層醇Himbacco0.234830月桂酸乙烯酯Vinyllaurate0.134930.362-十五酮2-Pentadecanone0.225030.79正十五碳醛Pentadecanal0.625130.7911-乙酸十二烯酯11-Dodecenyl acetate0.215232.949-十六碳烯醛9-Hexadecenal0.215333.5十六醛Hexadecanal0.965434.084-硝基苯基月桂酸酯4-Nitrophenyllaurate2.665535.12環十六烷Cyclohexadecane0.215635.5213-十八碳烯醛13-Octadecenal0.375737.039-十八烯醇9-Octadecen-1-ol0.205837.1813-異海松二烯13-Isopimaradiene4.545937.659,17-十八碳二烯醛9,17-Octadecadienal4.120.146037.78亞麻酸Linolenic acid3.866137.87 2,13-十八烷二烯-1-醇2,13-Octadecadien-1-ol0.166237.979-十八烯醛9-Octadecenal11.576338.34十八醛Octadecanal0.636439.03亞麻醇Linoleic alcohol5.326539.18油醇9-Octadecen-1-ol1.820.186639.58(7Z,10Z,13Z)-7,10,13-十六碳三烯醛 (7Z,10Z,13Z)-7,10,13-Hexadecatrienal0.216739.691-十八烯1-Octadecene2.026840.18葉綠醇Phytol3.980.606940.59角鯊烯Supraene1.767040.761-甲基環癸烯 1-Methyl-cyclodecene,0.507141.002,4-十二碳二烯酰基異丁酰胺2,4-Dodecadienoyl isobutylamide1.437241.409-十八烯酰2-[(Z)-9-Octadecenyloxy?ethanol0.437341.56亞麻酸乙酯Ethyl linolenate0.587442.712,6,10,14-十六烷-1-醇,3,7,11,15-四甲基2,6,10,14- Hexadecatetraen-1-ol,3,7,11,15-tetramethyl1.707544.50環戊烷-1,3-二甲酸甲酯Dimethylester-1,3-cyclopentanedicarboxylicacid0.727644.84油酸酰胺Oleamide0.267747.64二十烷Eicosane0.23總計Total(%)96.5999.92共同共有成分合計Total common components(%)52.5187.60

血小板是凝血機制的重要成分，不僅構成血小板-纖維蛋白栓子(Platelet-fibrin thrombi)，同時參與動脈粥樣硬化斑的形成，因此抑制血小板聚集是治療多種心腦血管疾病的重要手段之一。表2為竹葉花椒枝和葉精油對ADP誘導家兔血小板聚集的影響。由表可知1 mg/mL濃度下，竹葉花椒枝和葉精油對血小板聚集均有一定的抑制作用，葉精油抑制率為67.4%±24.0%，枝精油抑制率為14.3%±14.6%，葉精油的抑制率約是枝精油的4.7倍，因此葉精油的抑制效果顯著優于枝精油。葉精油與空白對照相比P< 0.01，差異顯著；枝精油與空白對照相比P> 0.05，差異不顯著；陽性對照Ticagrelor與空白對照相比P< 0.001，差異非常顯著。上述結果顯示竹葉花椒葉精油抗血小板聚集效果稍弱于Ticagrelor，此系精油作為天然混合物，其中的有效物質含量明顯低于成熟的純品藥物所致。與常規抗凝藥物Ticagrelor的高成本、高價格以及可導致心臟停搏、痛風和腎臟損害等多種嚴重副作用相比[20]，竹葉花椒葉優勢明顯。其屬于廢棄物，量大且幾乎零成本，精油成分主要為芳樟醇，2-十一酮，2-十三酮，D-檸檬烯等食品香精原料，毒性低，因此其開發為天然低成本心血管系統疾病藥物以及保健日化產品的巨大潛力值得關注。

表2 竹葉花椒枝和葉精油對ADP誘導家兔血小板聚集的影響

注：與空白對照比較，**P< 0.01；***P< 0.001.

Note:Compared with the control,**P< 0.01;***P< 0.001.

3 結論

竹葉花椒葉精油提取量為0.67 mL/kg，枝精油提取量為0.22 mL/kg，葉精油提取量高于枝精油。

竹葉花椒枝精油鑒定出48種化學成分，占化合物總量的96.59%，主要化學成分為2-十三酮19.09%，9-十八烯醛11.57%，β-石竹烯5.79%，2-十一酮5.58%，亞麻醇5.32%，芳樟醇5.21%；葉精油鑒定出45種化學成分，占化合物總量的99.92%，主要化學成分為芳樟醇62.01%，2-十一酮9.83%，2-十三酮5.47%，D-檸檬烯3.75%，4-萜品醇3.61%，1,8-對孟二烯2.27%。竹葉花椒枝和葉精油共同共有16種化學成分，分別占總含量的52.51%和87.6%。由于竹葉花椒枝和葉精油主要化學成分相似度較高，加之原材料易得，成本低廉，生產實踐中可考慮混合提取，作為開發優質香料、食用香精及醫藥保健品的原料選擇。

竹葉花椒枝精油對ADP誘導的家兔血小板聚集的抑制率為14.3%±14.6%，葉精油的抑制率為67.4%±24%，葉精油抑制效果顯著優于枝精油。竹葉花椒葉有開發為天然低成本心血管系統疾病藥物或相關產品的潛力。